己烯雌酚快檢試紙條制備及其在畜禽肉檢測中的應用

朱必婷 ，胡家勇 ，舒方明，周陶鴻，郭青青，汪佳

1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院（武漢 430075）；2.國家市場監管重點實驗室（動物源性食品中重點化學危害物檢測技術）（武漢 430075）；3.湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心（武漢 430075）；4.嘉魚縣公共檢驗檢測中心（咸寧 437200）

己烯雌酚（DES，結構式見圖1）為人工合成的二苯乙烯類雌激素類藥物，曾作為促生長劑被廣泛應用于畜牧業。DES對人的生育能力及生殖系統有很大影響，Herbst[1]研究表明，在個體發育的關鍵階段DES能夠導致組織發生改變，這些改變包括功能性或結構性的病理學改變，并且這種改變具有長期性，甚至會形成腫瘤。另外，Greenwald[2]研究表明DES和陰道癌之間有很大的相關性。Beral等[3]研究結果進一步顯示，DES的使用會增加卵巢癌的風險。有研究表明，DES的使用會增加心理疾病的發病概率，主要表現為憤怒、自卑、心理焦慮等[4]。

圖1 DES結構式

中國農業部第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中明確指出，禁止將己烯雌酚及其鹽、酯及制劑以任何用途用于所有食品動物[5]；農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》明確規定，己烯雌酚禁止用于所有食品動物，在動物性食品中不得檢出[6]。然而，部分地區仍將其用作漁業和畜牧業的促生長劑，可在養殖廢水和河流中被廣泛檢出，嚴重影響水生生態環境的安全，還可能通過食物鏈的富集作用對人體健康產生威脅[7]。有文獻報道[8]，某市城區動檢站對市場銷售的雞肉進行己烯雌酚含量檢測，從市面上隨機抽取40份樣品，檢測結果顯示，40份雞肉均檢出己烯雌酚。鑒于此，開展食品中己烯雌酚的檢測顯得尤為重要，國內外針對DES殘留的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法[9-11]、高效液相色譜法[12-15]、液相色譜-質譜法[16-17]、毛細管電泳法[18-20]、熒光分析法[21-22]、免疫分析法等[23-24]。這些方法存在前處理復雜、儀器昂貴、人員要求高、檢測周期長等缺點。

試驗研制己烯雌酚快速檢測試紙條，開發一種動物源性食品中己烯雌酚快速檢測的方法，該方法具有操作簡單、靈敏度高、精密度與重復性好、相對干擾少等優點，可滿足動物源性食品中己烯雌酚的快速檢測。建立動物源性食品中己烯雌酚的快速檢測方法，以期為動物源性食品中己烯雌酚現場檢測提供一個方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品（市售）。

己烯雌酚抗體、己烯雌酚抗原、羊抗鼠IgG（江南大學）；己烯雌酚標準溶液、己烷雌酚標準溶液、雙烯雌酚標準溶液（天津阿爾塔科技有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鉀、氯化鈉、吐溫20、甲醇、乙醇、曲拉通100、氫氧化鈉、二氯甲烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；膠體金（40 nm，上海捷寧生物科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、酪蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

HM3030XYZ三維劃膜噴金儀、ZQ2002微電腦自動斬切機（上海金標生物科技有限公司）；FICM600膠體金熒光免疫分析儀（蘇州和邁精密儀器有限公司）；5810離心機、5424R離心機（德國Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 碳酸鉀用量

取5支離心管，分別往里面加入1 mL膠體金，4 μL DES抗體，分別加入0，2，4，6和8 μL的0.2 mol/L碳酸鉀溶液，2 h后，觀察離心管中金標抗體探針的顏色，若仍保持為酒紅色，則為最佳的用量以穩定溶液的弱堿性和離子強度。

1.3.2 金標抗體探針的制備

取1 mL膠體金，加入4 μL的1 mg/mL DES抗體，充分振蕩搖勻后，靜置2 h，加入50 μL 10% BSA溶液封閉，放置2～8 ℃冰箱過夜，所標記的探針按12000 r/min離心15 min，用移液槍吸走上清液，棄去，沉淀用pH 8的Tris-HCl緩沖鹽溶液復溶，渦旋搖勻后置于冰箱中于2～8 ℃保存，待用。

1.3.3 單因素試驗

以0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.5%吐溫）作為檢測工作基本液，以牛血清白蛋白（BSA）使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、海藻糖使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、乙醇使用量（0.0，1.0%，3.0%，5.0%和10.0%）、氯化鈉使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、酪蛋白使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）、曲拉通100使用量（0.0，0.2%，0.5%，1.0%和2.0%）為影響因素，以0和3 μg/L的己烯雌酚標準溶液在試紙條上的T/C信號值為評價指標進行單因素試驗，每個因素水平進行3次平行試驗。

1.3.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，選出對靈敏度影響顯著的3個因素進行三因素三水平的正交試驗，因素水平表如表1所示。

表1 L9(33)正交試驗設計表 單位：%

1.3.5 試紙條的制備

試紙條組裝按照經典的四步法進行[25-26]。取出PVC底板，測量底板每一部分的長度和寬度，進行每一部分原材料適宜寬度和長度的剪裁。接著，將DES-BSA和羊抗鼠二抗用XYZ三維噴金劃膜儀劃線到NC膜上。將樣品墊、NC膜和吸水紙依次組裝在PVC底板上，為保證試紙條的流動性良好，在組裝時各部分要有一定的重疊，重疊1 mm左右即可，組裝完成后立即放入干燥箱中，于45 ℃干燥過夜，干燥完成后切割機切成寬度2 mm的試紙條，為保證試紙條的使用壽命，將制作好的試紙條與干燥劑一同放入鋁箔袋中封口保存。

1.3.6 樣品前處理

取5±0.1 g絞碎后的樣品加入到50 mL離心管中；加入10 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）渦旋30 s，加入15 mL乙酸乙酯振蕩3 min，按3000 r/min離心5 min，上清液為樣品液1；取10 mL樣品液1用空氣吹干儀吹干，吹干后加二氯甲烷200 μL渦旋15 s，加600 μL 1 mol/L NaOH溶液渦旋15 s，按3000 r/min離心5 min，上清液為樣品液2；取200 μL樣品液2，向其中加入15 μL 6 mol/L磷酸混勻，調pH 7～9，加200 μL檢測工作液混勻，作為待測液。

2 結果與分析

2.1 金標抗體探針碳酸鉀的最佳使用量

為保障金標抗體探針的穩定性，優化碳酸鉀的使用量。在保持其他條件不變的情況下，往1～6號離心管中添加0，2，4，6，8和10 μL的0.2 mol/L碳酸鉀溶液，金標抗體探針在過夜后觀察其顏色變化，由于1號未添加碳酸鉀，出現明顯死金的情況，金標抗體探針顏色變為深紫色。2～6號過夜之后可以觀察出較為明顯的顏色變化，隨著碳酸鉀的使用量增加，溶液的顏色逐漸變深，但2號離心管的金標抗體探針顏色仍然為酒紅色，因此確定制備金標抗體探針碳酸鉀的最佳使用量為2 μL。

2.2 劃膜濃度確定

由圖2可以看出，隨著T線劃膜濃度提高，T/C信號值呈上升趨勢，T線劃膜質量濃度0.4 μg/mL時，T/C信號值基本趨于最大值。由圖3可以看出，隨著C線劃膜濃度提高，T/C信號值呈下降趨勢，C線劃膜質量濃度0.25 μg/mL時，T線顯色與C線顯色相當，同時T線、C線劃膜濃度過低，T線、C線顯色過淺，因此確定T線、C線劃膜質量濃度分別為0.2和0.25 μg/mL。

圖2 T線不同劃膜濃度檢測結果

圖3 C線不同劃膜濃度檢測結果

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 BSA使用量

考察不同使用量的BSA對T/C信號值的影響。由圖4可以看出，BSA使用量不同，空白溶液的檢測結果T/C信號值在1.22～1.35，結果全為陰性，表明BSA對空白溶液的檢測影響不大。由圖5可以看出，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值在0.83～0.98，結果雖然全為陽性，沒有出現假陰性的情況，但BSA的使用對提升靈敏度并沒有效果，不過，BSA的增加組試紙條的顯色明顯優于未添加組，這是因為BSA的使用可增加檢測試劑（金標抗體或抗原）、捕獲試劑（抗原或二抗）的穩定性，由于增加檢測試劑、捕獲試劑的穩定性，從而改善T、C線的顯色。綜合空白溶液、3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果及試紙條顯色情況，BSA使用量選擇0.2%。

圖4 空白溶液信號檢測結果

圖5 3 μg/L己烯雌酚標準溶液信號檢測結果

2.3.2 海藻糖使用量

考察不同使用量的海藻糖對T/C信號值的影響。由圖6可以看出，海藻糖使用量不同，空白溶液的檢測結果T/C信號值在1.19～1.43，結果全為陰性，海藻糖對空白溶液的檢測影響不大。由圖7可以看出，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值在0.85～0.94，結果全為陽性，與BSA一樣，海藻糖的使用對提升靈敏度沒有效果，但海藻糖作為還原性單糖具有很多羥基，可以代替水分子與蛋白形成氫鍵，避免蛋白的變性和疏水區域暴露引起蛋白聚集及沉淀，此外，海藻糖還可改善NC膜的疏水性，利于緩沖液浸潤膜，從而改善T、C線顯色，故而，海藻糖使用量選擇0.2%。

圖6 空白溶液信號檢測結果

圖7 3 μg/L己烯雌酚標準溶液信號檢測結果

2.3.3 乙醇使用量

考察不同使用量的乙醇對T/C信號值的影響。由圖8可以看出，乙醇使用量不同，空白溶液的檢測結果T/C信號值在1.16～1.41，結果全為陰性，但乙醇使用量越大T/C信號值有降低趨勢。由圖9可以看出，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值在0.61～0.89，結果全為陽性，但明顯可以看出，乙醇的使用對提升靈敏度有一定效果，原因可能是乙醇作為共沉淀劑，可降低蛋白的穩定性，導致蛋白疏水性增強，從而可以增強蛋白與膜的結合，除此之外，己烯雌酚易溶于乙醇，一定體積分數的乙醇可增加己烯雌酚在緩沖液中的溶解性，利于己烯雌酚與實測試劑抗體的結合，因此可以適當改善試紙條的靈敏度。由空白溶液及3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果表明乙醇對試紙條的檢測結果影響較大，單因素試驗結果表明乙醇的最佳使用量為1%～3%。

圖8 空白溶液信號檢測結果

圖9 3 μg/L己烯雌酚標準溶液信號檢測結果

2.3.4 氯化鈉使用量

考察不同使用量氯化鈉對T/C信號值的影響。由圖10可以看出，氯化鈉使用量不同，空白溶液的檢測結果T/C信號值在1.22～1.41，結果全為陰性，氯化鈉對空白溶液的檢測影響不大。由圖11可以看出，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值在0.58～0.89，結果全為陽性，但明顯可以看出，氯化鈉的使用對提升靈敏度有一定效果，隨著氯化鈉使用量的增加，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值呈下降趨勢，原因可能有兩點：一是鹽溶效應，對于一些鹽溶性蛋白，氯化鈉的使用可以增加其溶解性，即降低其在緩沖液穩定性，這樣有助于蛋白與檢測試劑、捕獲試劑的結合；二是鹽析效應，鹽析作用可適當降低檢測試劑的穩定性，有助于檢測試劑與待檢測分子結合，從而提高靈敏度。由空白溶液及3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果表明氯化鈉對試紙條的檢測結果影響較大，單因素試驗結果表明氯化鈉的最佳使用量為0.5%～2.0%。

圖10 空白溶液信號檢測結果

圖11 3 μg/L己烯雌酚標準溶液信號檢測結果

2.3.5 酪蛋白使用量

考察不同使用量的酪蛋白對T/C信號值的影響。由圖12可以看出，酪蛋白使用量不同，空白溶液的檢測結果T/C信號值在1.26～1.38，結果全為陰性，酪蛋白對空白溶液的檢測影響不大。由圖13可以看出，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值在0.68～0.89，結果全為陽性，但明顯可以看出，酪蛋白的使用對提升靈敏度有一定效果，隨著酪蛋白使用量的增加，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值呈下降趨勢，原因可能是酪蛋白作為封閉劑，酪蛋白是一種堿性蛋白，結構緊密，可以形成疏水性表面，降低非特異性吸附，增加信噪比，從而可以提高試紙條的檢測靈敏度。由空白溶液及3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果表明酪蛋白對試紙條的檢測結果影響較大，單因素試驗結果表明酪蛋白的最佳使用量為0.25%～1.0%。

圖12 空白溶液信號檢測結果

圖13 3 μg/L己烯雌酚標準溶液信號檢測結果

2.3.6 曲拉通100使用量

考察不同使用量的曲拉通100對T/C信號值的影響。曲拉通100作為表面活性劑，可以改善界面張力，在層析中可以降低NC膜的表面張力，增加緩沖液與膜的浸潤性，從而利于抗原和抗體之間的反應，通常可以改善產品的分析性能，比如提高靈敏度、改善T、C線條顯色等。由圖14可以看出，曲拉通100的使用，空白溶液的檢測結果T/C信號值在1.22～1.49，結果全為陰性，曲拉通100的使用對空白溶液的檢測影響不大，同時可以降低顯色時間。但由圖15可以看出，曲拉通100使用量不同，3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果T/C信號值在0.81～1.07，曲拉通100的使用使得3 μg/L己烯雌酚標準溶液的檢測結果出現假陰性，說明曲拉通100的使用對試紙條靈敏度具有負面影響。雖然曲拉通100可以降低檢測時間，但是對試紙條的靈敏度有負面影響，己烯雌酚在食品動物中為禁用物質，產品的靈敏度是首要考慮的因素，所以，檢測工作液中不使用曲拉通100。

圖14 空白溶液信號檢測結果

圖15 3 μg/L己烯雌酚標準溶液信號檢測結果

2.4 正交試驗結果

GB/T 20766—2006《牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[27]作為畜禽肉中己烯雌酚快速檢測方法的參比方法，GB/T 20766—2006規定己烯雌酚的檢出限為1 μg/kg，為使快檢方法能夠到達參比方法的檢出限要求，提高試紙條的靈敏度就非常重要，根據單因素試驗結果，氯化鈉、酪蛋白、乙醇這3個因素會影響試紙條的靈敏度，因此此次試驗設計三因素三水平的正交試驗，以確定氯化鈉、酪蛋白、乙醇這3個因素的最佳使用量，從而提高試紙條的靈敏度，使得己烯雌酚快速檢測方法的最低檢測限能達到參比方法要求，正交試驗的試驗結果如表2所示。3號試驗結果試紙條的靈敏度最高，檢測工作液中氯化鈉、酪蛋白、乙醇的使用量分別為2.0%，0.25%和1.0%，此配方下空白溶液的T/C信號值為1.41，陰性檢測良好。正交試驗的理論最優方案是A2B1C3，是6號試驗，其結果試紙條靈敏度低于3號試驗，因此3號試驗為最優方案。根據單因素試驗結果及正交試驗結果，確定了檢測工作液的配方，即BSA、海藻糖、氯化鈉、酪蛋白、乙醇的使用量分別為0.2%，0.2%，2.0%，0.25%和1.0%。

表2 正交試驗結果表

2.5 方法學考察

2.5.1 試紙條的檢測限

在空白的畜禽肉樣本（雞胸肉、鴨肉、豬后腿肉、五花肉、牛肉、羊肉）中分別添加己烯雌酚標準溶液，含量分別為0，0.5，1.0，3.0和5.0 μg/kg，按照1.3.5進行樣品前處理，每個濃度重復3次，根據試驗結果確定試紙條的檢測限，試驗結果見表3。模擬樣本中己烯雌酚含量為0和0.5 μg/kg時，試紙條的顯示為陰性，即未能檢測到樣本中含有己烯雌酚，樣本中己烯雌酚含量達到1.0 μg/kg時，試紙條顯示全為陽性，即能夠檢測到樣本中含有己烯雌酚，因此將試紙條的檢測限定為1.0 μg/kg。

表3 己烯雌酚試紙條檢測限

2.5.2 試紙條的靈敏度

根據國家市場監督管理總局發布的食品快速檢測產品符合性評價中有關靈敏度的技術要求進行試紙條靈敏度的測定。食品快速檢測產品符合性評價技術要求目標物為禁用物質時，盲樣濃度水平包括空白樣品、檢出限的1倍濃度水平，每個濃度水平的盲樣不少于50份?？瞻讟悠芬钥疾炜鞕z方法及其產品的假陽性率，檢出限1倍濃度水平用以評價快檢方法及其產品的假陰性率。

按照食品快速檢測產品符合性評價技術要求進行盲樣的制備，其中包含50份空白的豬肉樣品及含量1 μg/kg的模擬陽性樣品。按照1.3.5進行樣品前處理，測試方法及產品的靈敏度，測試結果見圖16。由圖16可以看出，空白樣品的結果全為陰性，1 μg/kg的模擬陽性樣品的檢測結果全為陽性，因此，方法及試紙條的靈敏度為100%。

圖16 靈敏度測試結果

2.5.3 試紙條的交叉反應率

根據國家市場監督管理總局發布的食品快速檢測產品符合性評價中有關交叉反應率的技術要求進行試紙條交叉反應率的測定，交叉反應率（%）按式（1）計算。

交叉反應率=目標物的檢出限/干擾物質檢出陽性的最低濃度×100% （1）

將制備的試紙條分別對己烷雌酚、雙烯雌酚、苯甲酸雌二醇、己炔雌二醇進行測定，用己烯雌酚試紙條進行交叉反應試驗，根據試驗結果確定試紙條的交叉反應率，試驗結果見表4。己烷雌酚、雙烯雌酚的交叉反應率為33.3%，苯甲酸雌二醇、己炔雌二醇交叉反應率＜0.1。

表4 交叉反應率的測定

3 結論與討論

從金標抗體中碳酸鉀用量、T線劃膜濃度、C線劃膜濃度確定試紙條的研制的相關參數。通過單因素試驗、正交試驗確定檢測工作液配方。此外，從試紙條檢測限、靈敏度、交叉反應率3個方面考察試紙條的技術參數是否符合要求。結果顯示：試紙條最低檢測限為1 μg/kg，與參比方法GB/T 20766—2006《牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》檢出限一致，可滿足日常畜禽肉中己烯雌酚的快速檢測；試紙條靈敏度測試結果為100%；試紙條對己烷雌酚、雙烯雌酚的交叉反應率為33.3%，對苯甲酸雌二醇、己炔雌二醇交叉反應率＜0.1，其中，己烷雌酚、雙烯雌酚為己烯雌酚的同系物，皆為人工合成的非甾體雌激素物質，其對人體的負面傷害與己烯雌酚較為相似，故而己烷雌酚、雙烯雌酚也不應在食品動物中使用，所以當試紙條檢測結果呈陽性時可按照相關法律進行暫停銷售的處理。