桃過敏原的種類、制備、鑒定及檢測技術研究進展

桂沄坤，王鋒，馬路凱，劉袆帆，王琴，肖更生

仲愷農業工程學院輕工食品學院，農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室（廣州 510225）

桃（Prunus persicaL.Batsch）屬于薔薇科水果，在我國具有悠久的種植歷史和食用歷史，是最常見的植物性過敏食物之一。據歐洲共同體呼吸健康調查結果顯示，水果中最容易引發過敏反應的是桃。水果過敏屬于I型過敏反應，也稱為速發型超敏反應[1]。人接觸或攝入過敏原后，可誘導機體產生過敏原特異性免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE），致敏肥大細胞表面的IgE受體可與之結合，從而誘發人體的過敏反應[2]。水果過敏癥主要分為輕微口腔反應和全身系統性反應，還會伴有其他癥狀[3]。同種薔薇科水果在不同地區引發的過敏癥狀和嚴重程度不同，主要引發過敏的蛋白也呈現明顯的地區差異性[4]。此外，水果過敏所涉及的交叉反應現象對水果致敏機制和檢測技術研究有著很大影響。

水果作為日常生活中的一種必需品，為人體提供多種營養成分，但其誘發的過敏性疾病發病率在全世界范圍內不斷增加。在北京地區，2019年被診斷為過敏性疾病的804名患者（食物性過敏患者394例）中桃系列的陽性率排名第三，為13.2%[5]。桃過敏癥狀主要是口腔過敏綜合征，其次是蕁麻疹、胃腸道癥狀，以及少數結膜炎等[6]。桃能引起人體產生過敏癥狀的物質稱為桃過敏原，以4類蛋白家族為主，包括病程相關蛋白PR-10、非特異性脂質轉移蛋白家族、類甜蛋白家族和抑制蛋白家族。針對不同過敏原可選擇不同的分離方法，可采用鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀等對過敏蛋白進行粗提，進而結合多種分離技術進行純化。利用酶聯免疫吸附法、聚合酶鏈式反應、儀器檢測及蛋白印跡法等實現桃過敏原的精準分析。

文章介紹桃過敏原蛋白的種類和生物特性，對其分離純化及鑒定技術進行總結，并概括現有桃過敏原的檢測技術研究進展，以期為桃過敏原的制備、特性分析及致敏機制研究提供依據。

1 桃過敏原的種類及生物學特性

桃過敏原蛋白主要有Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3和Pru p 4。基于過敏原數據庫檢索和文獻資料分析，表1總結桃過敏原蛋白的種類、亞型及其生物特性信息。桃主要過敏原結構見圖1。

圖1 桃主要過敏原結構

表1 桃過敏原蛋白的生物學特性

1.1 桃過敏原Pru p 1

病程相關蛋白（pathogenesis-related proteins，PR）是植物受到侵染或者刺激后在處理部位（或者生長部位）誘導產生的一類蛋白質。PR蛋白主要分成17個家族，PR-10蛋白是由多基因家族編碼組成，其蛋白質序列高度可變[7]。桃過敏原蛋白Pru p 1屬于病程相關蛋白家族，是桃中主要的過敏原，具有易降解且不耐熱的特性[8]。Pru p 1蛋白有Pru p 1.0101，Pru p 1.0201和 Pru p 1.0301這3種天然亞型，前兩者主要存在桃子果實中，后者主要存在桃子花粉中。Pru p 1.0201與Pru p 1.0101具有相同甚至更強的致敏性[9]，且與免疫球蛋白E的結合能力高于另外兩者[10]。在中歐和北歐地區，桃過敏與樺樹花粉癥密切相關，可能是由于Pru p 1蛋白可與樺樹花粉中的過敏蛋白Bet v 1發生交叉過敏，從而導致樺樹花粉過敏的人群食用桃子后引起局部的口腔過敏癥狀。

1.2 桃過敏原Pru p 2

類甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLPs）屬于病程相關蛋白第五家族（PR-5），與甜蛋白結構高度相似，是一種抗真菌蛋白[11]。類甜蛋白是由3個結構域形成特殊的折疊結構，其基因可在植物的組織和器官中以不同活性表達，但表達水平與其他過敏基因相比較低[12]。桃過敏原Pru p 2屬于該蛋白家族，主要包括Pru p 2.0101，Pru p 2.0201和Pru p 2.0301。Pru p 2.0201是3種亞型中致敏活性最高的過敏原蛋白。Pru p 2.0101屬于堿性TLP蛋白，Pru p 2.0201屬于酸性TLP蛋白。堿性和酸性的TLP蛋白具有相同的氨基端和96%相同的氨基酸序列，但酸性TLP蛋白直接被驅動到非原質體空間，堿性TLP蛋白在特定應激條件下被運輸到液泡[13]。

1.3 桃過敏原Pru p 3

非特異脂質轉移蛋白（non-specific lipid transfer protein，nsLTP）屬于病程相關蛋白第十四家族（PR-14），在大多數植物性食物中發現可引起交叉反應。nsLTP通常與食物過敏的嚴重癥狀有關，可通過口服等多種途徑引發過敏[14]。多數nsLTP蛋白具有高度保守的結構，由8個保守的半胱氨酸殘基形成4個二硫鍵[15]，具有較高的熱穩定性、蛋白水解穩定性和交叉反應性。桃過敏原Pru p 3蛋白屬于非特異性脂蛋白，其蛋白疏水內腔可與一系列不同的配體結合。配體結合影響Pru p 3的羧基端某些保守氨基酸殘基的取向，并誘導構象變化，也可以改變過敏原的IgE結合能力，甚至改變其致敏性[16]。不同品種桃中Pru p 3.01含量具有較大差異，Pru p 3.01主要存在果皮、花藥和葉片中，在桃果實中富集較少。Pru p 3.02在葉片中含量豐富，Pru p 3.03在花藥中含量豐富，但兩者在果實組織中幾乎不存在。大部分地中海地區的桃過敏人群會對桃Pru p 3蛋白產生過敏反應[17]。Pru p 3最容易被IgE識別而發生交叉過敏反應[18]。

1.4 桃過敏原Pru p 4

多數抑制蛋白（Profilin）分子為12～15 kDa的能夠結合肌動蛋白的細胞溶質蛋白，可在特定病毒和所有真核細胞中表達。10%～20%的Profilin蛋白過敏人群會對花粉過敏原有過敏反應[19]。Profilin易被胃蛋白酶水解，具有熱不穩定性，可引起口腔過敏綜合征[20]。此外，Profilin也被認為是一種潛在的食物過敏原。桃過敏原蛋白Pru p 4屬于抑制蛋白家族，其與植物性食物和花粉中的其他致敏性蛋白非常相似，可與Bet v 2蛋白發生交叉過敏反應。其亞基Pru p 4.01可在大腸桿菌中進行外源表達，但表達量不高，與櫻桃、蘋果等其他薔薇科水果的基因型比較相近[21]。Pru p 4成員在桃果實的所有組織中均被檢測到相近的表達量，而Pru p 4.01在油桃果實組織中的含量比Pru p 4.02高。

2 桃過敏原的制備與鑒定

2.1 桃過敏原制備

鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀等多種提取方法可用于過敏原的分離，采用不同方法均可制備桃過敏原蛋白。表2總結了桃過敏原的分離方法。分離純化可分為2個步驟：先對桃粗蛋白進行提取，再純化獲得過敏原蛋白。盡管Pru p 1和Pru p 3都屬于病程相關蛋白家族，但兩者的性質卻截然不同，Pru p 1容易被分解，而Pru p 3具有良好的熱穩定性。由于不同桃過敏原具有不同的性質，可采取不同方法進行有效分離純化，并對其進行鑒定分析[22]。由于過敏原在桃果中的含量不高，直接提取分離難度較大，也可采用人工合成過敏原的方法制備大量過敏原蛋白。在獲知過敏原蛋白序列的基礎上，構建原核生物或真核生物蛋白表達載體，通過誘導宿主細胞產生過敏原蛋白。通過外源表達的方法直接制備過敏原蛋白，重組過敏原具有與天然過敏原相似的生物特性，可用于過敏原的特性分析與致敏機制研究。

表2 桃過敏原的制備方法

2.2 桃過敏原鑒定

過敏原鑒定主要是針對已經被分離純化出的致敏蛋白分子，利用免疫印跡技術（western blot，WB）分析過敏患者血清中過敏原的分子量區間與免疫活性，針對分離得到的過敏原蛋白，利用有效手段對其進行鑒定分析[26]。液相色譜-質譜聯用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）是過敏原分析中最常用的一種儀器分析方法，具有分析速度快及準確性高等特點，被廣泛用于食物過敏原蛋白的鑒定，通過質譜分析可以鑒定桃過敏原的蛋白結構、多肽序列、一級結構和分子質量等[27-29]。研究表明，利用LC-MS可以有效分析桃果中Pru p 1和 Pru p 3過敏原蛋白含量，并利用特征肽段的特性高效鑒定出Pru p 3過敏原蛋白，為低致敏桃品種的選育提供依據[30]。有研究建立一種基于液相色譜-串聯質譜-多反應監測的桃子過敏原精確定性定量檢測方法[31]，利用該方法鑒定3種桃過敏原蛋白的8個生物標志物肽，可用于不同種類桃中過敏原蛋白的精準定量分析。

3 桃過敏原檢測技術

基于蛋白質水平和基因水平均可實現食物過敏原的檢測分析。利用免疫學方法、生物傳感器、儀器檢測方法等對食物過敏原蛋白進行定量，也可利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）及基因芯片等實現過敏原特征基因的檢測[32]。但兩類檢測方法均有一定的局限性，且極易受到檢測環境因素的干擾[33]。桃過敏原檢測方法示意圖見圖2。

圖2 桃過敏原檢測方法示意圖

3.1 免疫學檢測方法

表3總結基于免疫學方法檢測桃過敏原蛋白的研究進展。酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）以其操作簡單、檢測速度快、靈敏度高等優點而被廣泛應用于食品安全免疫檢測領域[34]。馬英桃[35]利用雙單抗夾心ELISA方法對桃蛋白進行分析，鑒定8個桃品種果肉和果皮中Pru p 3含量，且果皮中Pru p 3含量高于果肉。免疫印跡法可以檢測不同加工食品的蛋白質及多肽[36]，也可用于分析水果過敏原蛋白。金靜[23]利用免疫印跡法對天然過敏原蛋白和重組過敏原蛋白進行分析。蛋白質芯片具有特異性高、操作簡單及高通量檢測等優點，可用于桃過敏原的快速分析[37]。

表3 免疫學方法檢測桃過敏原

表4 PCR及其衍生方法檢測桃過敏原

3.2 PCR及其衍生方法檢測

PCR檢測技術包括實時熒光PCR技術（Real-time Quantitative PCR，qPCR）[43]、多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR）[44]、普通PCR及液滴數字PCR（digital droplet Polymerase Chain Reaction，dd-PCR）等[45]，具有靈敏度高、特異性強及復雜體系分析簡單等優點。陳琳[46]利用扁桃和桃為親本雜交的個體作為模板，通過兩步PCR法克隆得到桃過敏原基因，共獲得35個序列和18個不同的桃過敏原基因，利用qPCR對桃過敏原基因家族成員進行檢測，結果發現大部分過敏原在桃果皮和花藥中的表達量高于果肉與葉片。對桃過敏原的nsLTP基因進行檢測，不同桃過敏原Pru p 3的差異表達與其基因序列相關性不大[35]。qPCR技術可被用于分析過敏原在不同生長時期或不同植物組織中的變化。

3.3 質譜儀器檢測

利用質譜鑒定可高效獲知過敏原的蛋白序列，不僅可用于對單個食品中的過敏蛋白的分析，還可對復雜基質中多個過敏原進行檢測[49]。利用質譜分析過敏原蛋白酶解后的肽段，不僅可模擬胃腸道對過敏原的消化作用[50]，還可用于桃過敏原蛋白的定量檢測。通過質譜分析可用于研究桃過敏原蛋白Pru p與IgE結合蛋白的結合特性。

4 結語

桃是日常生活中的一種常見水果，對人體有多種營養功能，但桃過敏卻嚴重影響人體健康和生命安全。文章總結概括桃過敏原蛋白的類別、制備方法、鑒定技術和檢測技術的研究進展，然而對桃過敏蛋白的交叉識別特性、致敏機制及不同桃品種中過敏原蛋白的差異性分析等內容的探討尤為不足，后續可加強這幾個方面的研究工作，對桃過敏原的基礎研究和檢測產品的開發具有重要意義。