亞臨界水提取固相分散萃取凈化測定人參中皂苷含量

李建民，莫慧娟，沈海波，康卷娟，劉善鑫，張連鋼

甘肅省嘉峪關市食品藥品和醫療器械檢驗檢測中心（嘉峪關 735100）

人參是一種多年生的草本植物，分布于我國東北三省地區[1]，被視為極具藥用價值的植物，中醫學認為其具有非常好的補益作用[2]。這是因為人參所含的多糖、人參皂苷等獨特的功效物質[3]。人參皂苷是一種固醇類化合物，具有增強體質、延緩衰老的功效[4-5]。由于人參的獨特功效，市場上出現很多人參加工產品，如人參口服液、凍干人參、人參蜜片、人參蜜餞等[6]。然而由于人參產量較低，品質參差不齊，所以高品質的人參產品價格居高不下，不法商家以次充好。所以嚴格控制人參制品的品質尤為重要[7]。

主要采用的檢測方法有分光光度法，需要大孔樹脂層析柱凈化，香草醛顯色測定[8]。該方法可檢測總皂苷含量，需要的檢測條件較低，但是該方法批間均一度很差；大孔樹脂對人參皂苷的吸附能力有限，試驗結果的穩定性和準確性很難得到保障。液相色譜法檢測的自動化程度高，能檢測不同結構的人參皂苷[9-10]，是一種較理想的檢測方法，其樣品前處理方法為乙醇水溶液回流提取、甲醇回流提取[11]、超聲輔助萃取[12-13]等，這對人參提取物制品中皂苷提取效率超過98%；但對人參、人參切片、人參蜜餞等植物基質樣品中皂苷的提取效率較低，由于植物細胞壁的保護導致，所以也導致最終檢測結果的不穩定性。因此，建立一套高效提取，凈化前處理樣品，并液相色譜兼容的檢測方法很有必要。

亞臨界水是處于水的沸點以上，并且體系壓力使水仍保持液體狀態的水。其具有很多優秀的特點，如亞臨界水在實際工作中，可以依靠控制溫度范圍，使亞臨界水呈現不同極性，有利于提取特殊極性范圍的目標物[14]。另外一個顯著的特點是其擁有較高的離子積，即高濃度的氫離子和氫氧根離子。溫度升高到200～300 ℃時，亞臨界水中水分子也會電離產生更多的氫離子和氫氧根離子，離子積可達10-11，較常溫常壓下提高1000倍。更容易與一些路易斯酸堿性物質結合，提高萃取效果[15-16]。同時隨著溫度的升高，水分子的氫鍵作用會減弱，氫鍵數量也會減少，亞臨界水的黏度和表面張力隨著溫度的升高而降低，較低的黏度和表面張力有利于物質的傳遞和滲透，從而提高提取效率，基于亞臨界水的諸多特性，可以考慮用于人參及其制品中人參皂苷的提取工作中。試驗結合親水親脂材料進行固相分散萃取凈化[17-18]，液相色譜檢測，建立高效、準確、穩定的人參皂苷檢測方法，以期為人參及人參制品的開發、質控提供良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參樣品（通化綠舒堂貿易有限公司）；乙醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；甲醇（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1（標準品，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；C18填料、PLS填料、PSA填料、大孔樹脂（分析純，杭州微米派科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀（安捷倫1260型，配二級管陣列檢測器，安捷倫科技有限公司）；離心機（RX-II型，天美中國科學儀器有限公司）；亞臨界水提取系統（5～100 L，鯤華生物技術有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 人參及其制品的樣品制備

干燥的人參樣品：將樣品粉碎過0.300 mm（50目）篩，得到粉狀篩下物，篩上物繼續粉碎研磨，至全部樣品通過50目篩。

新鮮人參樣品：將樣品粉碎，在均質器中10000 r/min，均質勻漿1 min。

人參蜜餞樣品：將樣品切成小于5 mm的小塊，放入凍干機中，真空冷凍干燥6 h，樣品變得疏松，質地變脆。此時將樣品粉碎過0.300 mm（50目）篩。

人參提取物保健品，固體樣品，粉碎即可；液體樣品可直接使用。

1.3.2 亞臨界水對人參樣品提取壓力和溫度條件優化

對亞臨界水提取肉蓯蓉的壓力，溫度條件進行篩選優化。分別以200，300，400，500和600 kPa這5個壓力條件以及150，170，190，210，240，270和300 ℃這7個溫度條件，做35組正交試驗。每份提取液，檢測其中6種人參皂苷化合物含量，以其含量高低，選擇最優的提取壓力和提取溫度作為樣品前處理提取條件。

1.3.3 亞臨界水對人參樣品提取時間優化

在最佳提取溫度和壓力條件下，分別以1，3，5，7和10 min這5個不同提取時間對同一份人參樣品進行提取。每份提取液，檢測其中6種人參皂苷化合物的含量，以其含量高低，確定亞臨界水對人參樣品最佳提取時間。

1.3.4 亞臨界水提取

稱取5 g制備好的人參樣品，精確到百分位。將樣品全部放入亞臨界水提取反應釜中，加入100 mL蒸餾水，密封好反應釜提取系統，在1.3.2所優化的條件下進行亞臨界水提取。提取時間為1.3.3所優化的時間。得到提取液，待凈化。

1.3.5 凈化材料選擇

根據DB22-T 1668—2012《人參食品中人參總皂苷的測定分光光度法》中方法規定使用大孔樹脂，自裝填柱層析對樣品進行凈化，檢測結果回收率不理想，所以選擇十八烷基鍵合填料（C18）、聚乙烯吡咯烷酮（PLS）、氨基填料（PSA）、大孔樹脂作為固相填料。采用固相分散萃取的方式，吸附1.3.4步驟中得到提取液中的人參皂苷。操作步驟：取25 mL提取液于50 mL離心管中，平行做4組試驗，分別加入C18、PLS、PSA、大孔樹脂各1.0 g。渦旋振蕩5 min，按5000 r/min離心3 min。棄去全部上清液，得到離心管底部白色沉淀。向其中加入1.0 g無水硫酸鈉和5.0 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，得到樣品待測液。分別測定上清液，待測液。以待測液中目標物含量確定有需要的吸附材料。

1.3.6 吸附時間和解析體積的優化

固相分散萃取需要一定的時間達到吸附平衡。對吸附材料進行解析也需要一定體積適當溶劑確保解析完全。選擇1，2，3，4，5，7和10 min這7個不同時間對樣品進行提取；選擇1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0和10 mL這7個不同體積甲醇對吸附材料進行解析。以待測液中目標物含量確定吸附和洗脫條件。

1.3.7 提取液凈化

將PLS作廢固相填料。向25 mL樣品提取液中加入1.0 g PLS，渦旋振蕩5 min，按5000 r/min離心3 min。棄去全部上清液，得到離心管底部白色沉淀。向其中加入1.0 g無水硫酸鈉，5.0 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，得到樣品待測液。

1.3.8 樣品測定

將待測液經過0.22 μm濾膜進入液相色譜檢測。色譜條件：色譜柱為ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水溶液，檢測波長202 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。分別稱取人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，搖勻待用。用甲醇稀釋至1.0～100.0 μg/mL的標準系列溶液。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到校準曲線。含量按式（1）計算。式中：X為目標物含量，g/kg；c為由標準曲線校準得到的樣品液中目標物含量，μg/mL；V為樣品液體積，500 mL；m為樣品質量，10.0 g；1000為毫克與微克的換算系數。

2 結果與討論

2.1 亞臨界水提取人參樣品的壓力和溫度條件優化試驗結果

35組棋盤試驗結果以曲面圖表示，如圖1所示。

圖1 不同提取壓力和溫度下提取液中人參皂苷含量

亞臨界水提取人參樣品，溫度和壓力升高，有利于提高亞臨界水提取人參皂苷的效率。得到提取液中人參皂苷含量升高。壓力≥400 kPa且溫度≥240℃時，Rg1、Re、Rb1達到最大提取效率；壓力≥400 kPa且溫度≥190 ℃時，Rc、Rd、Rb2達到最大提取效率。壓力≥600 kPa且溫度≥210 ℃時，Rg1、Re、Rb1達到最大提取效率；壓力≥500 kPa且溫度≥170 ℃時，Rc、Rd、Rb2達到最大提取效率。綜合考慮，反應體系中壓力增加帶來的成本增加遠高于升高溫度的成本，所以，考慮在完全提取的前提下，壓力和溫度折中的條件為最有提取條件，所以最終提取壓力400 kPa、提取溫度240 ℃。6種不同人參皂苷需要的提取溫度和壓力存在差異：一是因為每種皂苷在樣品中含量不同導致，含量較多的3種皂苷Rg1、Re、Rb1，不容易被提取，需要的條件更苛刻；二是因為每種皂苷結構差異，亞臨界水對不同結構的物質提取效率和條件也有所差異。

2.2 亞臨界水提取人參樣品所需時間優化

不同提取時間對提取效率的影響如圖2所示。

圖2 不同提取時間6種人參皂苷含量

隨著提取時間增加，亞臨界水對人參皂苷的提取效率也隨之增加。但提取時間超過5 min時，提取效率到達最大效果，繼續增加提取時間只會增加提取成本，皂苷含量不再增加。所以亞臨界水提取時間選擇5 min。由于亞臨界水低極性和高離子積的特點，可以提高對目標物的溶解度。同時，在高壓環境下，人參樣品很容易被破壞，內部所包含的目標物能快速溶解到亞臨界水中。所以整個提取過程可在短時間內完成。相比文獻[11,13]中記載的1 h和30 min，提取效率有大幅提高。所以亞臨界水用于人參皂苷的提取試驗中，無需有機試劑，短時間內可以完成提取過程，更加快捷穩定，有利于后續凈化和檢測試驗的進行。

2.3 固相分散萃取材料的選擇

不同的萃取填料對人參皂苷的吸附和解析效率存在很大差異。根據1.3.5步驟得到的試驗結果如表1和表2所示。

表1 不同填料對人參皂苷的吸附效果影響

表2 不同填料對人參皂苷的解析效果影響

由表1可知，經C18填料、PSA填料、大孔樹脂吸附殘留的上清液中仍然含有大量的目標化合物。而PLS填料吸附后上清液殘留量明顯低于3種填料。說明PLS在短時間，簡單渦旋振蕩操作條件下，即可對皂苷化合物到達高效率吸附。由表2可知，利用5 mL甲醇對吸附后的C18填料、PSA填料、大孔樹脂填料進行解析，無法完全解析，有部分目標物仍然殘留在填料中，無法滿足對化合物檢測回收率要求，而PLS填料在少量有機溶劑條件下，即可完全解析。完全滿足后續檢測要求。這是因為，C18填料和大孔樹脂對大部分有機化合物都有吸附效果，但吸附效率較低，需要在柱層析的條件下，多次吸附，才能達到吸附平衡。同理，在解析過程中，仍需要多次洗脫才能達到最優效果。所以該填料不適合作為固相分散萃取的填料。PSA填料對糖類，苷類等化合物有高效吸附特性，但是必須在乙腈條件下吸附效果才能達到最高，所以不適用于本試驗亞臨界水條件下的分散萃取。而PLS填料對水溶液中的含羥基的化合物有非常強的吸附能力。正好與試驗中采用的亞臨界水條件有極好的兼容性。

2.4 6種人參皂苷色譜行為

亞臨界水提取，PLS固相分散萃取，高效液相色譜檢測人參樣品中6種皂苷，色譜圖如圖3所示。

圖3 6種皂苷液相色譜圖

由圖3可知，6種保留時間分別為4.191，4.687，6.006，6.943，8.036和9.462 min，此液相色譜儀空氣保留時間為1.515 min。色譜峰理論塔板數按式（2）計算，分離度（R）按式（3）計算。

式中：tR為目標色譜峰的調整保留時間，即目標峰保留時間與空氣保留時間之差，min。W1/2為半峰寬。

式中：tRi為目標色譜峰的調整保留時間，min；Wi為目標色譜峰拐點峰寬。由數據可以計算出色譜峰的理論塔板數和分離度。計算結果如表3所示。

表3 目標物色譜峰理論塔板數和分離度計算結果

由表3可知，Rg1、Re、Rc、Rb1、Rb2、Rd的理論塔板數分別為5622，5924，10532，12559，15571和22392，液相色譜要求理論塔板數大于5000，所以6種目標物峰形對稱，滿足色譜分離要求。分離度均大于1.5，所以目標物色譜峰分離度良好，滿足色譜分離要求。

2.5 檢測方法的回收率和精密度

在人參樣品中加入6種標準物質，并做3組平行樣品。驗證方法回收率和精密度，結果如表4所示。

表4 實際樣品回收率及SRSD值試驗結果

由表4可知，該方法6種目標物的回收率分在90.59%～99.06%。SRSD≤3%，證明該方法結果準確、穩定，滿足檢測要求。由于本方法采用亞臨界水提取目標物，PLS填料分散萃取的方法處理樣品。相比文獻[11]比色法和文獻[13]液相色譜法回收率95%～99%相當，試驗方法操作更簡單，步驟更少，導致目標物散失的因素更少，目標物分子適中保存在樣品提取液中，沒有加熱，蒸餾，轉移，萃取等影響檢測結果準確性的試驗步驟。所以最終結果完全滿足準確度和精密度要求。

2.6 檢測方法檢測濃度范圍和檢出限

以線性范圍評價該方法的檢測濃度范圍，當3倍信噪比對應的濃度為儀器檢出限，以最低檢出限評價該方法靈敏度，結果見表5所示。

表5 線性范圍及方法檢出限

由表5可知，6種目標物均有較寬的線性范圍，5～500 μg/mL的線性范圍，對應0.02～4.0 g/kg的檢測范圍，滿足各類樣品中人參皂苷的檢測。由于試驗方法采用高倍濃縮，所以方法檢出限數值很低，滿足微量檢測要求。對部分皂苷含量較少的樣品液適用。

2.7 實際樣品檢測

利用所建立的方法，對新鮮人參，人參切片，西洋參含片，人參蜜餞樣品進行檢測。檢測結果如表6所示。

表6 實際樣品檢測結果

3 結論

亞臨界水與樣品在料液比1∶20（g/mL）、壓力400 kPa、溫度240 ℃條件下，僅需要提取5 min，能將人參樣品中人參皂苷提取到提取液中，較超聲提取，回流提取有明顯優勢，同時亞臨界水提取更加綠色、環保。在此基礎上利用PLS填料對提取液中目標物進行分散萃取，將目標物快速高效的富集在填料上。用少量有機試劑解析，PLS填料對水溶液中的人參皂苷具有極強的吸附能力，而甲醇對PLS中的人參皂苷也有極強的洗脫能力。這樣的現象確保該樣品前處理方法的快捷、簡便、高效、準確、穩定等特性。試驗所建立的亞臨界水提取，PLS固相分散萃取富集凈化處理人參樣品，通過液相色譜檢測方法具有良好的準確性，穩定性、靈敏度和檢測范圍。試驗操作步驟簡單，短時間內可完成檢測試驗得到檢測結果，適用于各類含有人參皂苷的樣品。該方法的建立也為亞臨界水在檢測領域的應用拓寬思路，也為固相分散萃取的應用提供一定試驗基礎。