木桶發(fā)酵醬油揮發(fā)性風味物質(zhì)研究及體外降壓活性分析

熊思瑞，王云峰，張智勇，喬祺，周明印，金鐵巖

延邊大學農(nóng)學院（延吉 133002）

醬油是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，一般由大豆和小麥粉經(jīng)過長達數(shù)個月的酶促釀造而成，可用于提高食品的風味和口感。大多數(shù)亞洲國家，特別是在中國、日本、韓國和泰國的各種肉類菜系中都被用于腌制和調(diào)味主要是因為東方食品消費量的增加[1]。醬油在中國歷史的長河中流長久遠，由于中國人民生活習慣大相徑庭，在釀造醬油所使用的原料及加工工藝上也都大不相同，甚至因為地域不同也能在產(chǎn)品的品質(zhì)方面感受到差異[2]。

天然發(fā)酵醬油中各種化合物超300種，而其中揮發(fā)性香氣成分占比90%左右，由此可知揮發(fā)性香氣成分對醬油成分貢獻之大[3]。醬油在發(fā)酵過程中或者是通過艾利希（Ehrlich）途徑從氨基酸中產(chǎn)生丙醇和散發(fā)出玫瑰香的苯乙醇等高級醇[4-6]，各種醇類化合物相互協(xié)作也可以提升醬油的風味[7]。通過一些催化發(fā)生還原反應產(chǎn)生能夠使醬油的味道變得柔和揮發(fā)性酯類[8]，并協(xié)同一些高級醇使氣味更為醇厚[9]。乙醛作為酵母與酒精發(fā)酵的中間代謝物與硫醇縮合產(chǎn)生芳香醛類化合物，能使醬油的味道更為復雜[10]。酮類中研究最多的呋喃酮類物質(zhì)是通過酵母代謝而產(chǎn)生的HEMF，這種呋喃酮類物質(zhì)可以使醬油具有特殊的焦香氣，除了可以增加味覺同時還兼具抗腫瘤活性[11-13]。具有代表性的揮發(fā)性酚類為具有丁香和煙熏味的4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基苯酚，其調(diào)節(jié)咸味的能力可使醬油的口感更加柔和[14]。戊糖與氨基酸置換會生成有堅果香及烘烤香吡嗪類化合物[15]。各個化合物間相互協(xié)作賦予醬油獨特的香氣。

腦出血與高血壓等心腦血管疾病的誘因之一就是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），人體血漿中高濃度的ACE可能會引發(fā)血管的病變以及血管壁增殖。將血管緊張素Ⅰ型轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ型是ACE酶的主要作用，ACE酶抑制劑能阻止已報道最高內(nèi)源升壓肽血管緊張素Ⅱ的生成[16]。醬油在發(fā)酵期間由于微生物的作用會將大豆蛋白質(zhì)分解成大豆多肽等若干低聚肽類。抑制ACE酶是大豆多肽最主要的一個生理活性功能。研究表明，大豆多肽的降血壓作用機制是它們抑制由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶催化的血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ的轉(zhuǎn)化，從而防止血管末端收縮產(chǎn)生降壓作用[17-18]。

為提高國產(chǎn)醬油的品質(zhì)、提高國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬油在國內(nèi)調(diào)味品市場的競爭力，研究木桶發(fā)酵醬油揮發(fā)性風味物質(zhì)并分析并研究其生理活性。利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對1組木桶發(fā)酵醬油與5組玻璃纖維發(fā)酵罐發(fā)酵醬油中揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分離，鑒定、定性分析及計算出6組供試醬油中各個揮發(fā)性風味化合物的相對含量，比較醬油不同醬油在揮發(fā)性物質(zhì)上存在差異，并結(jié)合電子鼻對6組供試醬油進行分析。通過體外降血壓試驗，進一步評價木桶發(fā)酵醬油對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的抑制作用，比較不同發(fā)酵容器發(fā)酵醬油在功能性方面的差異，旨在生產(chǎn)具有良好香氣和口感的優(yōu)質(zhì)醬油、或功能性醬油提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

木桶發(fā)酵醬油由好記食品釀造股份有限公司提供（代號S1）；其余5種均購于延吉市百貨大樓超市（代號分別為S2、S3、S4、S5、S6）。試驗所用醬油試樣信息如表1所示。

表1 6組醬油的基本信息

DB-wax毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；超純氦氣（體積分數(shù)≥99.99%）；無水乙醇（分析純），購自天津科密歐化學試劑有限公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）標準品、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE），購自Sigma公司；馬尿酸（Hippuric acid，HA）標準品，購自上海源葉生物科技有限公司）；乙腈、三氟乙酸、三乙胺、氯化鈉（均為色譜純），硼酸、四硼酸鈉（均為優(yōu)級純），購自上海上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水。

1.1.2 儀器與設備

味覺傳感系統(tǒng)（SA204B，日本Insent公司）；電子鼻（PEN3，德國AIRSENSE公司）；分析天平（FA324TC，上海力辰邦西儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-2，天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030，上海一恒科學儀器有限公司）；恒溫氣浴震蕩器（THZ-72S5，常州市國旺儀器制造有限公司）；高效液相色譜儀（LC-2010A，日本島津）；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B-5977B，美國安捷倫公司）；萃取頭（50/30 μm DVB/CAR on PDMS，西格瑪奧德里奇公司）；頂空固相微萃取（HS-SPME，西格瑪奧德里奇公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 醬油嗅覺成分的測定

電子鼻參數(shù)設置以及試驗方法參考范霞等[19]的方法，略作修改。準確吸取3 g樣品于容量40 mL的頂空瓶中后靜置，30 min后進行檢測。樣品準備時間與自動調(diào)零時間均設置為5 s，樣品測定檢測1 s，測定時長120 s，清洗時間150 s，內(nèi)部空氣流速300 mL/min，進樣流量300 mL/min。選取115～118 s檢測數(shù)據(jù)進行分析。

不同傳感器對應的化合物類型見表2。

表2 電子鼻不同傳感器對應物質(zhì)種類

1.2.2 醬油揮發(fā)性成分的測定

參考Wang等[20]的方法對6組醬油的揮發(fā)性成分進行測定。

使用配備DB-wax毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進行GC-MS分析。GC-MS分析的進樣為不分流進樣，進樣時間0.5 min。使用超純氦氣作為載氣進行分析，流量1 mL/min，柱流量1.50 mL/min，柱溫保持在40 ℃等溫5 min，以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持2.5 min。離子源和接口溫度分別保持在230 ℃和260℃。質(zhì)譜儀在全掃描模式下運行，并記錄m/z20～400范圍內(nèi)的質(zhì)譜。

試驗對檢測結(jié)果根據(jù)相似度、保留指數(shù)與峰面積進行定性及計算相對含量；將檢測得到的數(shù)據(jù)進行整理，根據(jù)沈嘉森等[21]的方法運用峰面積歸一法進行計算，求得各積分色譜峰占總峰面積百分比，進而測得不同發(fā)酵容器發(fā)酵醬油各組分相對含量。

1.2.3 醬油的體外降血壓活性

1.2.3.1 HPLC分析的樣品準備[21-23]

HPLC分析的總反應體積為800 μL，包括250 μL 6.5 mmol/L的HHL，50 μL 60 mU/mL的ACE酶及75 μL樣品溶液。

pH 8.2硼酸鹽緩沖溶液的配制：0.05 mol/L硼砂緩沖溶液（3.8114 g硼砂+200 mL超純水），0.2 mol/L硼酸緩沖溶液（6.184 g硼酸+500 mL超純水）。將140 mL 0.05 mol/L硼砂緩沖溶液與260 mL 0.2 mol/L硼酸緩沖溶液混合在一起。pH 8.2硼酸鹽緩沖溶液的配制（含NaCl）：在每100 mL pH 8.2的硼酸鹽緩沖溶液種添加0.351 g氯化鈉。

HHL：0.025 g HHL+9.929 mL pH 8.2的硼酸鹽緩沖溶液配制成6.5 mmol/L的HHL溶液。

ACE酶：0.1 U的ACE酶+1.67 mL硼酸鹽緩沖溶液配制成60 mU/mL的ACE酶溶液。

HA標準溶液：取適量馬尿酸對照品，用pH 8.2的硼酸鹽緩沖液配制成1 mmol/L的馬尿酸對照品儲備溶液，用pH 8.2的硼酸鹽緩沖液稀釋成不同濃度的馬尿酸標準溶液，備用。

樣品溶液：準確吸取1 g醬油試樣定容到100 mL容量瓶內(nèi)，配制成質(zhì)量濃度10 mg/mL的醬油溶液，用pH 8.2的硼酸鹽緩沖溶液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為2，4，6，8和10 mg/mL，備用。

取1.5 mL離心管備用，將ACE與樣品溶液分別移取50 μL和75 μL混合，在37 ℃保溫10 min后加入250 μL HHL溶液。恒溫振蕩器中在37 ℃與300 r/min條件下振蕩30 min，加入425 μL 1.0 mol/L的鹽酸溶液終止反應后過0.45 μm濾膜備用。同時用75 μL pH 8.2的硼酸鹽緩沖溶液代替醬油樣品溶液作為空白對照組進行分析。通過式（1）計算ACE抑制活性（%）。

ACE抑制率=（A-B）/A×100% （1）式中：A為空白組馬尿酸的峰面積；B為樣品中的馬尿酸峰面積。

1.2.3.2 HPLC分析條件

液相色譜條件：C18色譜柱，150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；按照洗脫梯度運行時間25 min；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長228 nm；進樣量10 μL。

洗脫條件及流動相：流動相A為水（超純水-三乙胺=99.9+0.01）；流動相B為乙腈（乙腈-三氟乙酸99.95+0.05）。程序設置如表3所示。

表3 HPLC梯度洗脫程序

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行分析，利用Excel進行計算繪圖分析，所得數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用皮爾遜檢驗法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油嗅覺成分的分析

6組供試醬油的PCA分析結(jié)果見圖1。在相關(guān)性矩陣模式下，第1主成分區(qū)分貢獻率為96.724%。除S2與S6外，其余4組均可被電子鼻顯著區(qū)分。這說明試樣之間具有各自的特性，使得醬油試樣具有各自不同的香氣特色，并且電子鼻可根據(jù)這些醬油試樣之間的不同香氣特點將其區(qū)分開來。

圖1 6組醬油電子鼻PCA圖

通過Loadings分析PCA在相關(guān)性矩陣模式圖中6號傳感器W1S對第1主成分區(qū)分貢獻率最大，8號傳感器W2W對第2主成分區(qū)分貢獻率最大。由圖1可知，6組樣品在PC2軸的距離很近，差異不大，而在PC1軸上的距離較遠，在PC1軸上距離由遠及近依次是S5、S3、S6、S2、S4、S1。說明樣品的主要嗅覺成分差異體現(xiàn)在第1主成分上。

由電子鼻采集6組醬油115 s時10個傳感器的電阻比值如表4所示，可以看出不同醬油10個傳感器的電阻比值不一致。6組醬油試樣的2，6，7和8號傳感器G/G0值相對其他傳感器電阻比值高，說明6組醬油中揮發(fā)物中含氮氧化合物、甲基類化合物、無機硫化物、醇醛酮類化合物相比其他化合物含量較高。分析表明，醇類及甲基類化合物是鑒別醬油品質(zhì)的重要物質(zhì)。

表4 6組醬油10個傳感器電阻比值（G0為空氣電阻值）

2.2 醬油中揮發(fā)性風味物質(zhì)種類和含量的分析

由表5可知，S1、S2、S3、S4、S5和S6共6組醬油分別檢測出72，69，59，75，55和49種揮發(fā)性風味物質(zhì)，S1的酯類化合物與醛類化合物的種類均高于其他5種醬油試樣，說明由木桶發(fā)酵醬油產(chǎn)生的酯類與醛類物質(zhì)的種類較玻璃纖維發(fā)酵醬油在香氣上更加復雜多樣。

表5 6組醬油揮發(fā)性物質(zhì)種類

由表6可知，6組醬油中共檢測出130種揮發(fā)性風味物質(zhì)，包括26種酯類化合物、18種醇類化合物、8種酸類化合物、11種醛類化合物、15種酮類化合物、12種酚類化合物、烴13種類物質(zhì)、13種吡嗪類物質(zhì)和14種其他類物質(zhì)。

表6 6組醬油的揮發(fā)性風味物質(zhì)

如圖2所示：醇類物質(zhì)在6組醬油試樣中的占比均最大，S1、S2、S3、S4、S5和S6中醇類物質(zhì)所占的比例分別為52.1%，64.5%，65.64%，63.72%，67.65%和71.58%；酯類物質(zhì)所占的比例分別為13.57%，4.8%，7.3%，11.87%，7.84%和7.25%；酸類物質(zhì)所占的比例分別為4.64%，5.03%，4.15%，2.79%，4.35%和0.11%；醛類物質(zhì)所占的比例分別為12.44%，11.39%，9.91%，10.77%，11.25%和13.3%；酮類物質(zhì)所占的比例分別為1.45%，0.15%，0.23%，0.86%，0.19%和0.76%；酚類物質(zhì)所占的比例分別為3.57%，4.12%，4.42%，4.53%，3.63%和1.91%；烴類物質(zhì)所占的比例分別為0.57%，4.16%，4.24%，0.09%，0.22%和0.03%；吡嗪類物質(zhì)所占的比例分別為5.82%，2.69%，1.27%，2.86%，2.47%和2.1%；其他類物質(zhì)比例分別為6.24%，3.13%，2.16%，2.65%，1.95%和2.92%。

圖2 6組醬油中揮發(fā)性風味物質(zhì)比例圖

醬油中所含的醇類、酯類、醛類、酸類和酮類等是醬油香氣的重要組成部分。由表5和圖2可知，6組供試醬油所檢測出的揮發(fā)性風味物質(zhì)中醇類化合物的含量均為最高，說明醇類化合物是決定醬油風味的重要化合物。6組醬油試樣中S1的酯類物質(zhì)、醛類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、吡嗪類物質(zhì)及其他類物質(zhì)的相對含量均高于其他5組醬油試樣。

醬油揮發(fā)性成分中含量最多的是醇類，這些醇類物質(zhì)的主要來源是來自醬油原料的成分當中的，其次在醬油發(fā)酵的過程中也會形成這些物質(zhì)，在醬油發(fā)酵過程中所生成的低級醇主要是以乙醇為主，乙醇也是在發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌的代謝產(chǎn)物[24]，除乙醇這種低級醇外，還會生成一些高級醇類，有研究表明，高級醇是通過艾利希途徑從氨基酸中衍生而來的[25]。

酯類物質(zhì)共26種，主要以乳酸乙酯和乙酸乙酯居多，醬油在發(fā)酵過程中會從原料大豆內(nèi)生成一些高級脂肪酸，都對醬油的芳香氣味有正向影響，S1中的酯類物質(zhì)較其他5組試樣種類多，相對百分含量也多，有研究指出，溫度及水解會導致酯類物質(zhì)的損失[26]，這也說明木桶在溫度的控制上發(fā)揮了作用，能夠產(chǎn)生更多的酯類化合物。

在酚類中，在所有測試樣品中檢測到4-乙基-2-甲氧基苯酚與2,4-二叔丁基苯酚，在S2與S5中檢測出4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，有研究已確定4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚是影響醬油香氣的重要香氣成分[27]。Meng等[28]報道酚類物質(zhì)在掩蓋紅酒和醬油果香方面的負面影響，因此可以表明4-乙基-2-甲氧基苯酚在影響醬油的最終質(zhì)量方面發(fā)揮作用。

吡嗪被認為是重要的特征香氣化合物，具有濃厚的醬香味主要與烘烤和堅果香氣，F(xiàn)eng等[27]指出吡嗪沒有貢獻，因為它們的氣味閾值高。在測試樣品中鑒定出13種吡嗪，除2,6-二甲基吡嗪對醬油品質(zhì)無明顯影響外，檢出的吡嗪類化合物含量對醬油品質(zhì)有顯著負向影響。在抑制葡萄酒的果香方面也觀察到這種負面影響[26]。這表明這些吡嗪類化合物可能被認為是醬油中的重要香氣缺陷。

醛類物質(zhì)有11種。其中2-甲基丁醛主要是通過艾利希途徑降解例如纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸而產(chǎn)生的[29]，并且已被確定為對麥芽氣味有很大影響。表6中顯示醬油S1中2-甲基丁醛相對含量最高，這種成分對醬油的整體香氣做出顯著且積極的貢獻[30]。

在醬油中的酸類中乙酸在測試樣品中占主導地位，乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸使醬油散發(fā)出酸味，并大幅增加醬油的香氣。有研究表明[31]，乙酸可與醇反應生成相應的乙酸酯，從而賦予各種果香。因此，有理由認為酸對醬油的整體香氣具有積極作用。

6組醬油試樣共檢測出的15種酮類化合物，木桶發(fā)酵醬油S1的酮類化合物的相對含量最高（1.45%），醬油中的酮可以產(chǎn)生甜味，并促進形成令人愉悅的香氣，如青草味、果味和焦糖味[32]。酮類化合物對醬油最終質(zhì)量的不同影響有明顯的區(qū)別，這證實它們在醬油芳香成分中的作用是顯著的，能夠?qū)︶u油的最終品質(zhì)產(chǎn)生積極影響。也可以間接證明木桶發(fā)酵對醬油發(fā)酵過程中的酮類物質(zhì)的產(chǎn)生有一定正面作用。多項試驗證實[33-35]，醬油的香氣受原料、發(fā)酵時間和發(fā)酵容器的影響顯著。

2.3 醬油的體外降血壓活性的分析

6組醬油試樣對ACE抑制率如圖3所示。6組醬油對ACE酶均有一定抑制作用，6組醬油試樣的ACE抑制率隨著樣品濃度增加而逐漸增大，呈正相關(guān)趨勢；醬油質(zhì)量濃度10 mg/mL時，試樣S1的抑制率顯著高于其余5組，達51.1%。

圖3 6組醬油對ACE酶的抑制率

經(jīng)過計算得出6組供試醬油的IC50值及IC值如表7所示，6組醬油試樣都有一定的ACE酶活性抑制作用。但S1對ACE酶的抑制效果更加突出。因此可以說明木桶發(fā)酵醬油在一定程度上已被證明通過抑制ACE酶的活性和增強其抑制作用而具有一定保健功能。

表7 6組醬油抑制ACE酶的IC50值

根據(jù)五明紀春等[36]的研究，在醬油長時間的發(fā)酵過程中，由于原料中的蛋白水解物與還原糖之間產(chǎn)生美拉德反應，進而會產(chǎn)生一些類黑精。這些因美拉德反應所產(chǎn)生的黑色物質(zhì)含有氨基側(cè)鏈，這可能對ACE有抑制效果。ACE是血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的酶，據(jù)研究表明[37]，測定類黑精抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的作用是在體外環(huán)境下所得到的結(jié)果。木桶發(fā)酵醬油在反應液的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，也能抑制51.1%的ACE的活性。然而，ACE作為一種分布在動脈血管壁細胞中的酶，類黑精是否能在人體內(nèi)到達其作用部位是未來研究的課題。

3 結(jié)論

醬油中含有較多的揮發(fā)性風味物質(zhì)，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）檢測6組樣品，共檢測出130種香氣化合物，包括26種酯類物質(zhì)、18種醇類物質(zhì)、8種酸類物質(zhì)、11種醛類物質(zhì)、15種酮類物質(zhì)、12種酚類物質(zhì)、13種烴類物質(zhì)、吡13種嗪類物質(zhì)及14種其他化合物。同時采用峰面積歸一化法計算出木桶發(fā)酵醬油S1中酯類、酮類和吡嗪類化合物的相對含量為6組試樣中最高（分別為13.27%，1.45%和5.82%）。6組醬油樣品的主體風味成分的組成及貢獻程度不同。乙酸乙酯、苯甲醛、2,3,5-三甲基吡嗪等這化合物都能對醬油香氣的形成起到至關(guān)重要的作用，但是它們的貢獻程度卻不同。除此之外，愈創(chuàng)木酚、4-乙基-愈創(chuàng)木酚等酚類物質(zhì)也能對不同醬油樣品賦予不同香氣與味道。在體外降血壓的研究中，6組供試醬油對ACE酶都有一定抑制作用，但在測定濃度范圍內(nèi)，木桶發(fā)酵醬油S1對ACE的抑制效果顯著高于其他5組，IC50值為10.23 mg/mL。