表面增強拉曼光譜法測定保健食品中非法添加物硝苯地平

皮江一，周陶鴻，林津，彭青枝

1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院（武漢 430075）；2.國家市場監管重點實驗室（動物源性食品中重點化學危害物檢測技術）（武漢 430075）；3.湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心（武漢 430075）

保健食品以其安全性高、不良反應小等特點而受消費者追捧。近些年，一些制假分子利用保健食品成分復雜、質量標準不完善及消費者對健康的心理需求，推出一大批具備“治療”效果的保健食品，而這些保健食品存在夸大宣傳療效、售價高、成分不明確等問題[1-2]，如在降壓類保健品中添加化學成分硝苯地平等藥物[3-4]。患有冠心病、心絞痛的高血壓患者在不知情條件下長期服用該類保健食品，并同時服用其他類降壓藥物，易引起頭痛、心悸、竇性心動過速、血壓驟然下降等不良反應，并可能伴隨經常性的休克以至于出現心衰[5-6]。原國家食品藥品監督管理總局辦公廳在2016年發布《關于開展保健食品等三類食品非法添加非法聲稱問題專項治理工作的通知》中指出，抽樣檢驗保健食品時重點檢驗降壓類等藥物。

檢測以硝苯地平為主類藥物（C17H18N2O6）的方法多為實驗室檢測，如薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）及液質聯用（HPLS-MS）[7-11]和紅外光譜法[12-13]等，色譜法在檢測靈敏度、選擇性上有較強優勢，但是色譜法檢測好時較長，前處理方法較為復雜且需要有專業技能的人員，使得現場檢測難以廣泛展。表面增強拉曼散射（Surface-enhanced Raman Spectroscopy，SERS）作為一種分子指紋光譜，具有靈敏度高、熒光背景低、樣品處理簡單、操作簡便等優點[14-15]，且無需專業技能人員，表面增強拉曼通常以金或銀的膠體或者附著以金或銀的納米粒子為基底，當分子受到合適頻率的入照光照射激發下，會產生表面增強拉曼散射[16]。近些年，將SERS應用于食品安全、農藥及非法添加，環境污染檢測方面顯示出巨大的應用潛力[17-18]，而如何制備出良好的拉曼信號增強基底成為研究熱點。基于此，通過采用檸檬酸還原法制備膠體金溶液，制備出不同粒徑和不同濃度的膠體金溶液[19-20]，以三聚氰胺為內標，建立一種基于SERS技術快速定量保健食品中非法添加硝苯地平等降血壓類藥物的方法，其中激光拉曼儀檢測結果反應迅速，使得對未知物的篩查得以迅速開展[21-22]。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸三鈉：國藥集團化學試劑有限公司；硝苯地平、尼群地平、尼莫地平（中國藥品生物制品研究所）。

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（武漢科爾儀器設備有限公司）；顯微共聚焦拉曼光譜儀（英國雷尼紹公司，inVia）；激光粒度儀（Mastersizer 3000E，Malvern有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠體金制備

一般采用還原氯金酸的方法制備膠體金，常用有白磷還原法、檸檬酸三鈉還原法、枸杞酸三鈉還原法。采用檸檬酸三鈉還原法制備，根據配制不同比例及濃度的氯金酸和檸檬酸三鈉溶液，可以制備出粒徑范圍在16～147 nm的不同濃度的膠體金粒子。

稱取1.0 g氯金酸溶于100 mL超純水中，即配制成濃度1%氯金酸溶液，取1.0 g檸檬酸三鈉于100 mL超純水中過0.22 μm濾膜，即檸檬酸三鈉濃度1%。取250 mL圓底燒瓶，加入100 mL超純水和1 mL 1%氯金酸溶液，開啟磁力攪拌器，打開冷凝回流管，緩慢攪拌加熱至微沸，迅速加入一定量0.40，0.50，0.70，1.00，1.50和2.00 mL）1%的檸檬酸三鈉溶液，在攪拌過程中，會發現溶液由黃色向紫紅、棕色轉變，繼續加熱5 min后取下燒瓶冷卻至室溫，保存于棕色試劑，共得到6種不同粒徑的納米金膠。確定具備較強拉曼信號的膠體金制備配比后，取250 mL圓底燒瓶，加入100 mL超純水和1 mL 1%氯金酸溶液，后續操作步驟同上，分別加入0.80 mL和0.90 mL檸檬酸三鈉溶液，得到拉曼信號較強的2種粒徑金膠。將1 mL氯金酸+0.90 mL檸檬酸三鈉這組膠體金制備出4組（1.0 mL+0.9 mL，2.0 mL+1.8 mL，3.0 mL+2.7 mL和4.0 mL+3.6 mL）不同濃度的金膠溶液。

1.2.2 膠體金質量評價及粒徑、濃度確定

通過目測法可以得到不同粒徑的膠體金形成過程中的外觀特征，采用紫外-可見光風光光度計在200～800 nm進行區段波長掃描，記錄6種不同粒徑金膠吸收波長曲線。使用粒度儀檢測膠體金粒徑范圍，粒度儀需開機預熱20 min，測量前樣品應充分混勻，確保大小顆粒在體系中分散均勻。

1.2.3 拉曼光譜儀測定條件

曝光時間5 s，激光功率25 MW，掃描次數1次，物鏡倍數50 L，激光波長785 nm，光柵1200 L/mm，掃描范圍650～1700 cm-1。

1.2.4 三聚氰胺及硝苯地平的SERS檢測

在測量瓶中依次加入500 μL納米金溶膠、100 μL待測液、100 μL 1%的氯化鈉溶液混勻后上機檢測，每次需做平行檢測。得到不同粒徑及濃度的三聚氰胺和西地那非拉曼信號圖，根據峰強確定增強因子最大的膠體金粒徑及其濃度。其中，SERS增強因子的計算如式（1）。

式中：EF為增強因子；ISERS/CRaman為加入膠體金待測液的拉曼信號強度與該濃度下的比值，IRaman/CSERS為一定濃度待測液（不加膠體金）拉曼信號強度與該濃度下的比值。

1.2.5 標準曲線繪制

稱取0.1 g（精確至0.0001 g）硝苯地平，用10 mL乙腈溶解，用水定容至100 mL，制備質量濃度1 mg/mL使用液，并將其稀釋成質量濃度分別為10，20，40，60，80和100 μg/mL的標準系列中間液。分別取1 mL標準中間液與1 mL內標溶液三聚氰胺充分混勻，得到質量濃度10，20，40，60，80和100 μg/mL的標準系列工作液，按上述檢測條件，混勻后上機檢測。以硝苯地平濃度為橫坐標，硝苯地平特征峰1334 cm-1與三聚氰胺特征峰707 cm-1的峰高比為縱坐標進行線性回歸擬合，其中三聚氰胺內標質量分數設置50 mg/kg。

1.2.6 保健食品中輔助降血壓類藥物的SERS檢測

實際樣品檢測：稱取0.1 g（液體1 mL）搗碎樣品于10 mL離心管中，向離心管中加入3 mL乙酸乙酯，渦旋萃取3 min后，離心分層，上層有機相為提取液。吸取0.5 mL提取液于2 mL離心管中，氮吹后加入乙腈，渦旋3 min，為待測液。依次向檢測瓶中加入500 μL納米金增強試劑、100 μL待測液和100 μL 1%的氯化鈉溶液，混勻上機檢測。

2 結果與分析

2.1 不同粒徑膠體金外觀判定及紫外光譜表征

6種不同加入量的檸檬酸三鈉，加入量1.5和2.0 mL時，所得到的膠體金顏色呈葡萄酒紅色，此時的膠體金粒徑較小，視覺良好透明度高，無懸浮顆粒出現。當加入量1.0和0.7 mL時，膠體金呈現深紅色。加入量0.4和0.5 mL時，呈磚紅色。檸檬酸加入量0.40 mL時，膠體金透明度較低，肉眼可見明顯顆粒懸浮出現，放置一段時間出現聚沉（圖1）。

圖1 不同粒徑膠體金顏色

表1 膠體金制備-檸檬酸三鈉法 單位：mL

對100 mL 0.01%氯金酸中不同添加量檸檬酸三鈉（2.0，1.5，1.0，0.7，0.5和0.4 mL）制備的6種粒徑膠體金進行200～800 nm波段掃描，得到掃描圖譜（圖2），均有明顯吸收峰，隨著還原劑檸檬酸三鈉添加量減少，膠體金溶液最大吸收峰從520 nm移至550 nm。

圖2 不同粒徑膠體金紫外吸收光譜

2.2 三聚氰胺和硝苯地平拉曼光譜及其定性檢測

拉曼光譜信號圖號稱指紋圖譜，這意味著不同物質都有其相對應的特征拉曼光譜信號圖，試驗分別以三聚氰胺和硝苯地平、尼群地平、尼莫地平為測試物，采用的檢測儀器為顯微共聚焦拉曼光譜儀。由圖3可以看出，三聚氰胺的特征峰為707 cm-1和1091 cm-1，降血壓類藥物硝苯地平、尼群地平、尼莫地平特征峰為1334 cm-1和1642 cm-1，根據該特征峰，可對保健食品中的硝苯地平進行定性判定，否則不能判定樣品中是否含有硝苯地平，需進一步試驗驗證。

圖3 三聚氰胺與硝苯地平表面增強拉曼光譜圖

2.3 膠體金的粒徑和濃度和對拉曼光譜響應的影響

2.3.1 金膠的粒徑大小對拉曼信號響應的影響

試驗以50 mg/kg三聚氰胺和硝苯地平標液為檢測對象，加入不同含量檸檬酸三鈉制備的膠體金，以三聚氰胺特征峰1091 cm-1和硝苯地平特征峰1334 cm-1處的峰值強度為繪制表。由表2可以看出，隨著檸檬酸加入量的增加，峰值強度呈現先上升后下降趨勢，檸檬酸三鈉加入量分別為0.7，0.8，0.9和1.0 mL時，對應的拉曼峰強值由低到高，到峰值后由逐漸降低，由此表明拉曼信號強度與膠體金粒徑相關，其拉曼峰強在檸檬酸三鈉添加量0.9 mL時達到最高。

表2 三聚氰胺和硝苯地平檢測數據表

通過粒徑儀分析，在100 mL 0.01%氯金酸中添加0.9 mL 1%檸檬酸三鈉時，由圖4得知其制備的膠體金粒徑在85.4 nm左右有較強信號，在8.8 nm處也出現部分信號強度。

圖4 膠體金粒徑分布及信號強度

2.3.2 金膠濃度大小對拉曼信號響應的影響

試驗確定在100 mL純水中加入1 mL 1%氯金酸溶液和0.9 mL 1%檸檬酸三鈉溶液（1.0 mL+0.9 mL）可制備出拉曼增強效果較好的膠體金溶液。由表3可知，拉曼信號強度隨著膠體金濃度的增加先上升而后平穩，在氯金酸和檸檬酸三鈉添加量分別為3.0 mL和2.7 mL時，拉曼增強信號最強，增強因子EF（三聚氰胺）=2.7×103，EF（西地那非）=2.1×103。

表3 三聚氰胺和硝苯地平檢測數據表

表4 硝苯地平定量數據表

2.4 以三聚氰胺為內標對硝苯地平樣品的定量檢測

2.4.1 內標的選擇以及標準曲線的繪制

試驗選擇加入50 mg/kg的三聚氰胺作為內標，以硝苯地平濃度為橫坐標，以硝苯地平特征峰1334 cm-1與三聚氰胺表面增強拉曼特征峰707cm-1的峰高比為縱坐標進行線性回歸擬合（I1334/I707），由圖5可以看出在0～100 mg/kg質量分數范圍內，峰高比（I1334/I707）與西地那非濃度呈良好線性關系，線性擬合相關系數R2=0.9958，由此可以說明表面增強顯微拉曼光譜法定量檢測保健食品中非法添加物西地那非具有可行性。

圖5 硝苯地平定量表面增強拉曼光譜圖

圖6 硝苯地平定量線性曲線

圖7 硝苯地平定性檢測拉曼光譜圖

2.4.2 加標樣品定量檢測以及檢出限

試驗選取經國標檢測方法篩選出不含硝苯地平、尼群地平、尼莫地平陰性樣本2個，其中1個為膠囊丸，1個為液體，編號分別為A、B。按照試驗的樣品前處理方法對3個樣品進行前處理，添加一定濃度的硝苯地平標準品溶液，使得樣品質量分數為20，50和80 mg/kg，編號為A-1，A-2，A-3，B-1，B-2和B-3，結果如表5所示。固體加標樣品方法的回收率為88.8%～96.5%，SRSD為4.17%，液體加標樣品的方法回收率為90.2%～96.6%，SRSD為3.49%，加標樣品的測試結果表明表面增強顯微拉曼光譜法可滿足保健食品中硝苯地平含量的定量檢測要求。

表5 實際樣品中硝苯地平測定

2.5 方法檢測限

設置一系列質量分數0，5和10 mg/kg硝苯地平標準品，空白無峰出現，5和10 mg/kg均出現硝苯地平的拉曼特征光譜圖，其定性檢測線為5 mg/kg。對于一些低含量樣品的檢測，可采取氮吹的方式對提取液進行濃縮。

3 結論

基于便攜式拉曼光譜技術，制備增強試劑膠體金以及對保健食品中非法添加硝苯地平的進行定性、定量檢測。對于制備的增強試劑膠體金的性能評價采取目測評價、紫外光譜表征及標準品測試。結果表明，拉曼增強試劑膠體金制備的最佳比例為100 mL超純水中加入3.0 mL 1%氯金酸和2.7 mL 1%檸檬酸三鈉，其中標品測試物三聚氰胺及西地拉非展現出較強的指紋圖譜信號。對于保健品中非法添加降血壓藥物硝苯地平的定性結果表示，在拉曼圖譜（1334±3）cm-1和（1642±3）cm-1處有明顯特征峰，可用于該類藥物的定性檢測。另外，表面增強拉曼光譜法以50 mg/kg三聚氰胺作為內標定量保健食品中硝苯地平含量結果顯示，該方法檢測限為5 mg/kg，線性回歸方程為y=0.0223x+0.1457，線性相關系數為0.9957，固體試樣加標回收率為88.8%～96.5%，液體試樣加標回收率為90.2%～96.6%，與液相質譜對比顯示出方法的可靠性。

便攜拉曼對于食品中非法添加物的檢測具有靈敏度高、特異性強、檢測耗時少等優點，可用于對大量樣品的定性、定量篩查，而得到較強的拉曼圖譜信號的關鍵在于制備有效的增強試劑材料。試驗發現，當膠體金粒徑在一定范圍中增大時，對待測物的拉曼檢測圖譜響應越強，但是粒徑增大到一定量時效果減小，原因是膠體金團聚沉淀，從而失去增強效果。試驗對后續增強材料的制備提供基礎方法及思路，同時，以三聚氰胺作內標定量硝苯地平，為保健品中非法添加降血壓類藥物硝苯地平提供備選方法。