蛋白酶種類對牡蠣酶解液揮發性風味成分的影響研究

羅一穎，奚藝珺，唐海霞，彭惠意，陳雪認，楊昭

1.廣東食品藥品職業學院食品學院（廣州 510520）；2.韓山師范學院生命科學與食品工程學院（潮州 521041）

牡蠣（Crassostrea gigas）是一種優質的海水養殖貝類。2020年我國牡蠣產量達542.46萬 t，占我國海洋養殖貝類總量的36.65%[1]。鑒于牡蠣的高營養價值與高產量，牡蠣的應用與研究逐年增多。大量研究表明牡蠣酶解產物具有多種生理活性和加工適用性，是制備高品質調味品的重要基礎風味物質[2-3]。風味是牡蠣酶解產物的重要感官品質，是其加工適用性的重要限制性因素。揮發性風味成分是人類感官嗅聞能夠感知的化合物，對酶解產物風味有重要影響。研究者圍繞牡蠣酶解過程揮發性風味成分的變化進行大量研究。鄧嫣容[4]采用溶劑萃取法直接進樣，利用氣相色譜質譜聯用儀從復合蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出20種化合物。劉曉麗等[5]采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法從木瓜蛋白酶和中性蛋白酶牡蠣酶解液中分別鑒定出60和62種化合物。蘇明月等[6]采用電子鼻和頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法從堿性蛋白酶0，1和3 h牡蠣酶解液中分別鑒定出化合物31，32和36種。在前期研究過程中，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法從復合蛋白酶0.5，1.0，4.0和8.0 h牡蠣酶解液中分別鑒定出化合物51，52，60和51種。蛋白質酶解是復雜的過程，受蛋白酶種類、底物種類、反應條件等多種因素影響。動物蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶為水產品酶解常用蛋白酶，鮮有研究者關注其對牡蠣酶解液揮發性風味成分的影響。

因此，為探究常見蛋白酶種類對牡蠣酶解液風味品質的影響，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法對不同蛋白酶牡蠣酶解液的揮發性風味成分進行分析鑒定，以期為高品質牡蠣酶解液開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣肉（購于廣東饒平，購回實驗室后迅速用超純水清洗，用塑料袋包裝為1 kg/袋，置于-18 ℃冰箱凍存備用）；動物蛋白酶（4000 U/g，食品級，宏景生物科技有限公司）；風味蛋白酶（500 LAPU/g，食品級，諾維信中國公司）；堿性蛋白酶（20萬U/g，食品級，河南萬邦實業有限公司）；中性蛋白酶（20萬 U/g，食品級，河南萬邦實業有限公司）；胰蛋白酶（4000 U/g，食品級，河南萬邦實業有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉（分析純，上海阿拉丁生化技術股份有限公司）。

1.2 儀器和設備

KS-1053多功能料理機（廣州市祈和電器有限公司）；H1850R離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；BSA2202S型電子天平[精度10 mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；ATX224型分析天平[精度0.1 mg，島津儀器（蘇州）有限公司]；GCMS-QP2010 ultra氣相色譜質譜聯用儀（日本島津制作所）；50 μm二乙苯基/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷手動固相微萃?。⊿olid phase microextraction，SPME）進樣手柄和手動固相微萃取頭（美國Supelco公司）；Rts-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Restek公司）；FE22-Standard pH計[梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司]。

1.3 牡蠣酶解液制備

參考楊昭等[7]的方法，略微調整。取凍藏袋裝近江牡蠣肉置于流動水中解凍，解凍后的牡蠣肉加入等質量的去離子水，制成勻漿。采用0.05 mol/L鹽酸溶液或0.05 mol/L氫氧化鈉溶液調節勻漿pH至蛋白酶最佳反應pH，加入相應質量的蛋白酶，置于搖床中振蕩酶解，每隔1 h用0.05 mol/L鹽酸溶液或0.05 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至蛋白酶最佳反應pH。酶解結束后采用沸水浴20 min進行滅酶，降溫后在4 ℃，6793×g條件下離心20 min，收集上清液為牡蠣酶解液，-18 ℃保存備用。按照表1酶解條件制備不同蛋白酶牡蠣酶解液。

表1 蛋白酶的酶解條件

1.4 揮發性風味成分分析

1.4.1 揮發性風味成分提取

凍藏牡蠣酶解液置于室溫下解凍30 min后，稱取3.0 g解凍的牡蠣酶解液放入萃取瓶。萃取瓶置于55 ℃下平衡10 min，插入已老化的DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附1 h后拔出，用于GC-MS檢測[8]。

1.4.2 揮發性風味成分鑒定

揮發性成分參照文獻[8]測定。色譜柱條件：Rts-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。進樣條件：高純度氦氣（99.999%）以0.8 mL/min速度流入，輸送管路溫度230 ℃。解吸溫度230 ℃，解吸時間5 min。升溫程序：初始溫度35 ℃（維持2 min），以4 ℃/min的速率升溫至40 ℃（維持2 min），以5 ℃/min的速率升溫至100 ℃（維持10 min），繼續以10℃/min的速率升溫至230 ℃。質譜條件：電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，掃描范圍m/z35～500。

1.4.3 揮發性風味成分定性分析

通過NIST11質譜庫對檢測出的各化合物進行對比檢索，保留相似度大于80%的化合物。結合相關文獻對檢索的化合物定性，以面積歸一化法確定各揮發性風味成分的相對含量，僅統計相對含量≥0.1%的化合物[9]。

1.5 數據處理

每個試驗重復3次，數據用平均值±標準差表示。采用Microsoft Excel 2016進行作圖和數據分析。

2 結果及分析

2.1 5種牡蠣酶解液的總離子流圖

動物蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5種牡蠣酶解液揮發性風味成分的總離子流圖如圖1～圖5所示。從整體上看，揮發性風味成分的總離子流色譜圖的分離度較好，揮發性風味成分的出峰時間主要集中在10～15 min和35～40 min。劉曉麗等[5]采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法鑒定木瓜蛋白酶和中性蛋白酶牡蠣酶解液時，揮發性風味成分的出峰時間主要集中在15～20 min與試驗第1個集中出峰時間一致，但試驗在35～40 min也獲得大量揮發性成分。原因可能是劉曉麗等[5]采用的是PDMS萃取頭，試驗采用的是DVB/CAR/PDMS萃取頭。由于萃取頭上的涂層種類不同，會導致對揮發性成分的吸附量存在的差異，最終引起檢測成分種類和含量的差異。DVB/CAR/PDMS可以特征性吸附多種揮發性成分，近年來被廣泛應用于牡蠣揮發性成分的富集[10-11]。同時，從總離子流色譜圖上也可以看出5種牡蠣酶解液中各揮發性風味成分的豐度差異。豐度可直觀反映成分的含量，豐度越大，含量越大?？傮w來看，胰性蛋白酶牡蠣酶解液中主要揮發性成分的含量較高。

圖3 堿性蛋白酶牡蠣酶解液的總離子流圖

圖4 胰性蛋白酶牡蠣酶解液的總離子流圖

圖5 中性蛋白酶牡蠣酶解液的總離子流圖

2.2 5種牡蠣酶解液的揮發性風味成分種類和含量分析

由表2和表3可知，5種蛋白酶牡蠣酶解液共鑒定出化合物45種，其中醇類6種、酚類1種、醛類12種、烴類10種、酮類9種、雜環類4種、酯類3種。動物蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出化合物22種，其中含有2種醇類（21.82%）、1種酚類（0.26%）、7種醛類（34.21%）、5種烴類（2.85%）、3種酮類（25.47%）、1種雜環類（0.24%）、3種酯類（1.91%）。風味蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出化合物19種，其中2種醇類（15.18%）、6種醛類（22.29%）、5種烴類（4.62%）、5種酮類（26.44%）、1種酯類（0.60%）。堿性蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出化合物19種，其中2種醇類（20.92%）、8種醛類（39.43%）、2種烴類（1.45%）、4種酮類（22.83%）、1種雜環類（0.78%）、2種酯類（0.84%）。胰蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出化合物19種，其中3種醇類（22.48%）、7種醛類（35.59%）、4種烴類（2.00%）、3種酮類（27.48%）、1種雜環類（0.22%）、1種酯類（0.40%）。中性蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出22種化合物，其中2種醇類（19.58%）、9種醛類（32.72%）、4種烴類（2.28%）、2種酮類（27.76%）、2種雜環類（0.63%）、3種酯類（1.34%）。

表2 牡蠣酶解液揮發性風味成分的相對含量

表3 牡蠣酶解液揮發性風味成分的種類和數量

在鑒定的7種化合物中，醛類、醇類、酮類、酯類化合物的閾值相對較低，對氣味貢獻較大。為探究蛋白酶種類對牡蠣酶解液揮發性風味成分的影響，對鑒定的牡蠣酶解液揮發性風味成分進行分析。

醛類物質為脂肪氧化的主要產物，對水產品風味影響較大[12-13]。研究表明醛類物質是導致腥味存在的因素之一，即便在含量極少的情況下，由于其有疊加效應亦會對風味產生影響[14]。被檢出的12種醛類物質中，2-己烯醛具有青草香氣，反-順-2,6-壬二烯醛具有強烈的紫羅蘭和黃瓜似香氣[15]。這2種化合物在動物蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶3種牡蠣酶解液中均存在，2-己烯醛相對含量相對較低，是潛在風味化合物，反-順-2,6-壬二烯醛則被認為是牡蠣肉中關鍵的揮發性風味物質[16]。癸醛具有海味、十四醛具有強烈桃子似香氣、十二醛呈現脂肪香和瓜果香[8,14,17]，幾種化合物均呈現令人愉快的氣味。苯甲醛呈現出焦糖類似味和苦味，辛醛和壬醛在5種酶解液中均被檢出，辛醛具有魚腥味，壬醛為油酸和亞油酸氧化后的產物，呈塑料味和腥味[18-20]。蘇國萬等[15]研究表明，壬醛為牡蠣酶解液中的關鍵揮發性風味化合物之一。張梅超[21]發現壬醛是牡蠣酶解液中腥臭味、哈喇味的主要物質之一。試驗中壬醛為5種牡蠣酶解液中含量最高的醛類，在動物蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5種酶解液中相對含量分別為4.74%，6.13%，3.42%，2.86%和4.09%。

醇類化合物多數由酯類進行氧化分解后得來，或是羰基化合物進行還原反應后產生[20]。其中：飽和醇類閾值較高，對風味影響較??；不飽和醇類閾值較低，對風味影響較大，其一般表現為蘑菇味、金屬味，亦是形成牡蠣風味重要物質之一[16,21]。1-辛烯-3-醇為5種酶解液中含量最多的揮發性成分，其為花生四烯酸氧化降解的產物，主要貢獻出牡蠣中特有的類似蘑菇的香氣,但有土腥味，1-辛烯-3-醇亦是牡蠣酶解液中關鍵的風味化合物之一[24,14]。其在動物蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5種酶解液中相對含量分別為20.34%，14.38%，14.98%，21.24%和19.38%。

酮類可能由脂肪酸氧化、降解和氨基酸降解產生，對腥味有一定增強作用[15]。2-壬酮呈現水果、花、油脂和藥草似香氣，是鮮活牡蠣中的鮮味的主要化合物[25]。但5種牡蠣酶解液中檢測出的酮類物質數量較少、含量較低。在5種酶解液中未發現共有的酮類化合物，只有3-癸烯-2-酮在風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶3種酶解液中存在。

酯類物質由醇和羧酸通過酯化反應生成，一般來說與美拉德反應有關，有部分可能由于酶解過程中加熱滅酶這一步驟而產生，一般具有顯著香味特征，主要呈現出愉悅性氣味如花香、甜香、青草香、奶油香、水果香等[11,26-27]。研究表明其是新鮮牡蠣中鮮香氣味的主要來源，但在5種牡蠣酶解液中含有的酯類化合物種類較少，相對含量也較低[28]。動物蛋白酶牡蠣酶解液中的1,2-苯二甲酸雙（2-甲基丙基）酯相對含量為1.06%，為5種牡蠣酶解液中相對含量最高的酯類化合物。

烴類化合物是來自脂肪酸烷氧基的均裂，其大多數呈現較為愉快的風味，如甜香味，以具有支鏈的烷烴為典例，亦有研究提出烴類化合物對于提高牡蠣整體風味有一定作用[29-30]。但由于烴類化合物整體閾值相對較高，且檢出的10種烴類化合物相對含量都較低，對酶解液的風味造成的影響有限[31]。

2.3 5種牡蠣酶解液獨有的揮發性風味成分分析

獨有的揮發性風味成分可能是某種蛋白酶酶解液的特征性風味成分，對評估牡蠣酶解液的風味有重要影響。2,4-二叔丁基苯酚、二十六烷、植酮為動物蛋白酶解液中獨有的揮發性風味成分，其中2,4-二叔丁基苯酚具有特殊烷基酚氣味。異胡薄荷醇、2-甲基二十四烷、5-叔丁基-環庚烯、6-甲基-2庚酮、2-乙基己酰氯、反式香葉基丙酮為風味蛋白酶解液中獨有的揮發性風味成分，其中異胡薄荷醇具有薄荷香氣。乙酸-1-降莰烷甲醇、十二醛、2-壬酮、2,5-二甲基吡嗪為堿性蛋白酶解液中獨有的揮發性風味成分，其中十二醛具有強烈的脂肪香氣。2-乙基-1-己醇、二十一烷為胰蛋白酶解液中獨有的揮發性風味成分。十六醇、6-甲基-3-辛炔、2,6,10,14-四甲基-十六烷、1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸（2-嗎啉-4-基乙基）-酰胺、吡嗪，3-乙基-2,5-二甲基為中性蛋白酶解液中獨有的揮發性風味成分。

3 結論

通過固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法探討5種蛋白酶對牡蠣酶解液揮發性風味成分的影響。從5種蛋白酶牡蠣酶解液中共鑒定出化合物45種，其中醇類6種、酚類1種、醛類12種、烴類10種、酮類9種、雜環類4種、酯類3種。動物蛋白酶牡蠣酶解液和中性蛋白酶牡蠣酶解液中鑒定出化合物22種，風味蛋白酶牡蠣酶解液、堿性蛋白酶牡蠣酶解液和胰蛋白酶牡蠣酶解液中各鑒定出19種化合物。醛類和醇類化合物對水產品的風味影響較大。從動物蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5種牡蠣酶解液中分別鑒定出7,6,8,7和9種醛類化合物，分別鑒定出2,2,2,3和2種醇類化合物。試驗結果可為高品質牡蠣酶解液的開發奠定理論基礎，也為后期牡蠣酶解過程中風味變化機制和關鍵風味產生途徑研究提供參考。