重組大腸桿菌產耐熱α-L-鼠李糖苷酶高密度發酵條件的優化

葛 林，劉英英，周芳名，展凌玲

（蘇州健雄職業技術學院生物醫藥學院，江蘇 太倉 215411）

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）廣泛存在于自然界中，如哺乳動物組織、植物、真菌、細菌等[1-4]。該酶是一種應用廣泛的糖苷水解酶，它能高效水解多種末端含有非還原性鼠李糖殘基的天然化合物，如水解蘆丁為異槲皮苷[3]，水解淫羊藿苷C 為淫羊藿苷[5]，水解柚皮苷為普魯寧等[4]。此外，少數α-L-鼠李糖苷酶還能以L-鼠李糖為供體，通過逆水解反應催化合成鼠李糖苷，如甘露醇鼠李糖基化、酚類化合物鼠李糖基化等[6，7]。迄今為止，根據CAZy 數據庫，α-L-鼠李糖苷酶分屬于三大糖苷水解酶家族，即GH13 家族、GH78家族和GH106 家族[8]，其中大部分屬于GH78 家族。此外，α-L-鼠李糖苷酶是一種重要的酶，在食品和制藥工業中有著廣泛的應用。然而，目前報道的α-L-鼠李糖苷酶普遍產量不高，到目前為止，全球還沒有商品化的α-L-鼠李糖苷酶產品，這極大限制了該酶在工業上的應用。

大腸桿菌是遺傳背景最清楚的菌株，其具有培養成本低、抗污染能力強、生長周期短、蛋白表達量高等優勢，已經成為最常用的外源蛋白表達系統。采用高密度發酵技術，能顯著提高所培養的菌體密度，最終增加單位體積單位時間內目的產物的比生產率，縮減生產周期，提升經濟效益，已經在工業中有很廣泛的應用[9]。在大腸桿菌高密度發酵中，大多采用補料分批發酵方式，以實現高密度的大腸桿菌和所需的蛋白質生產[10]。這種補料方式一方面可以避免因某些營養成分初始濃度過高而出現底物抑制現象，另一方面又能夠防止因限制性營養成分被耗盡而影響細胞的生長和產物的形成。重組大腸桿菌高密度發酵是一個復雜的過程，需要對其生長的發酵參數進行優化，如葡萄糖進料速率、誘導溫度、誘導pH等。葡萄糖是一種便宜且速效碳源，在大腸桿菌發酵生產中優于其他碳源。但是，在有氧條件下，過多的葡萄糖會導致大腸桿菌代謝副產物的產生。最常見的副產物是乙酸，它是由磷酸轉乙酰酶（PTA）/乙酸激酶（ACKA）和丙酮酸氧化酶（POXB）兩種途徑產生的[11]，主要原因是加入中央代謝系統的碳與細胞呼吸或三羧酸循環的有限能力之間不平衡[12]。乙酸的積累通常發生在大腸桿菌的快速生長期，尤其是在所需蛋白質合成的誘導階段，會抑制生長和產物的形成[13]。因此，對于補料分批發酵生產重組耐熱α-L-鼠李糖苷酶來說，構建一種避免補料不足或過量的補料策略是極其重要的。在確保溶解氧恒定的情況下，誘導溫度和誘導pH對高密度發酵過程誘導后代謝乙酸的積累量產生影響[14]。在高溫條件下加速細胞的新陳代謝和生長，導致大量乙酸的形成[15]。誘導后的pH值是通過添加氨水形成銨鹽來降低乙酸濃度的關鍵因素。然而，高濃度的NH4+對能源效率和大腸桿菌的生長有負面影響[15]。到目前為止，關于調控乙酸來提高耐熱α-L-鼠李糖苷酶產量的影響還未見報道。

在我們前期的研究中，克隆了來源于Thermoclostridium stercorariumDSM 2910 的GH78 家族的α-L-鼠李糖苷酶（TstRhaA），在最優的搖瓶水平最佳表達條件下，該酶最高酶活力僅有25.2 U/mL，產量遠不能達到工業化需求。在本研究中，我們研究了在7.5 L 發酵罐中發酵生產耐熱α-L-鼠李糖苷酶時，葡萄糖補料策略、誘導溫度和誘導pH對副產物乙酸生成量及TstRhaA酶產量的影響，最終發現通過控制乙酸的生成量，能夠顯著提高TstRhaA 的產酶量，最高酶活力達到589.0 U/mL，研究結果為大規模生產TstRhaA提供了技術保障。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

重組基因工程大腸桿菌BL21（DE3）/pET20b-TstRhaA由筆者前期構建并保存，目的基因來自于Thermoclostridium stercorariumDSM 2910。

1.2 主要試劑

二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀、葡萄糖、硫酸銨、七水合硫酸鎂、乙二胺四乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-硝基苯基-α-L-鼠李吡喃糖苷（pNPR），Sigma 公司；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司；氨芐青霉素鈉（Amp）、異丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）、消泡劑、氯化鈉、檸檬酸、氨水，上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 主要儀器

Agilent 7820A 氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；JY98-III DN 型超聲波破碎儀，南京思麥盛醫療生物科技有限公司；BioFlo 310 型發酵罐，蘇州牧笛自動化科技有限公司；D-1 型自動蒸氣滅菌鍋，北京發恩科貿有限公司；ZHWY-2102C 搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；BS124S 電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；ZHWY-10X 水浴鍋，上海智城分析儀器制造有限公司；多功能酶標儀，鞏義市英峪予華儀器廠；AIR TECH US-1300L-U 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；艾本德5418R臺式高速冷凍離心機，上海璞珉科技有限公司；UV9000紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；LC-SPX-250B型生化培養箱，上海力辰儀器科技有限公司。

1.4 主要溶液與培養基

1.4.1 主要溶液

（1）IPTG 溶液（1 mmol /L）：精確稱取2.383 g IPTG，加入適量無菌水溶解，定容至10 mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，-20℃備用。

（2）Amp 溶液（100 mg/mL）：精確稱取1 g 氨芐青霉素鈉，加入適量無菌水溶解，定容至10 mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，-20℃備用。

（3）pNPR 溶液（5 mmol/L）：精確稱取14.3 mg pNPR，加入適量無菌水溶解，定容至10 mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，-80℃備用。

1.4.2 主要培養基

（1）LB 固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L。

（2）種子培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

（3）發酵培養基：二水合磷酸二氫鈉4.2 g/L，三水合磷酸氫二鉀8.7 g/L，酵母提取物50.0 g/L，葡萄糖30 g/L，硫酸銨5.5 g/L，七水合硫酸鎂2.5 g/L，乙二胺四乙酸1.1 g/L，微量元素混合液1 mL/L，消泡劑0.3 g/L。

（4）補料培養基：二水合磷酸二氫鈉12.6 g/L，三水合磷酸氫二鉀26.0 g/L，酵母提取物200 g/L，葡萄糖800 g/L，硫酸銨16.5 g/L，七水合硫酸鎂20 g/L，乙二胺四乙酸3.3 g/L，微量元素混合液3 mL/L，消泡劑0.3 g/L。

1.5 試驗方法

1.5.1 重組大腸桿菌發酵生產TstRhaA

（1）種子活化

取-80℃甘油保存的菌種，在超凈工作臺中于氨芐抗性的LB 固體培養皿上進行四區劃線法劃線，倒置放37℃生化培養箱中培養12～20 h。

（2）種子液培養

從活化平板上挑取單菌落于50 mL 種子培養基（含50 mg/L Amp）中，放入37℃、180 r/min 的搖床中培養12～16 h。然后按照2%的接種量接入到含有150 mL 新鮮發酵液體培養基（含50 mg/L Amp）中，于37℃、1 800 r/min 條件下培養10 h。

（3）發酵罐培養

在7.5 L發酵罐中裝入3.0 L的初始發酵培養基（含50 mg/L Amp），接種量為2%，攪拌速度為300～1 200 rpm，控制溶氧（DO）≥15%，空氣流速為60 L/h，培養溫度為37℃，用100%的氨水和25%的HCl 來調節發酵pH 在7.0±0.1。當發酵培養9 h 時，將IPTG 以固定的速率添加到初始培養基中，開始誘導表達重組蛋白。

通過溶氧（DO）或pH 值的變化來反饋生物反應器中的剩余葡萄糖，然后采用指數流加和兩階段流加策略啟動分批補料[10，16]。由底物基本質量平衡可知，不同比生長速率下的補料速率（F，mL/h）為：

式中：μ—比生長速率（h-1）；μset—誘導前比生長速率；μ′set—誘導后比生長速率；X0—細胞初始濃度（g/L）；V0—初始培養體積（L）；YX/S—細胞對葡萄糖的理論產率；SF—補料培養基中葡萄糖濃度；t—培養時間。

基于上述結果，進一步研究不同誘導溫度（30℃、33℃、37℃、42℃）和不同誘導pH（6.8、7.0、7.2、7.4）對重組大腸桿菌發酵生產TstRhaA的影響。

1.5.2 TstRhaA酶活力測定方法

以5 mmol/L pNPR 為底物。反應體系：75 μL 50 mmol/L 檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，20 μL 底物，混勻預熱后加入5 μL 酶液，在酶的pH 6.5 和65℃下反應10 min。之后加入0.3 mL 1 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應，立即冷卻，混勻并離心5 min 后在405 nm條件下測定其吸光值。以不加酶液的反應體系做對照。

TstRhaA 酶活力單位（U）定義為：在pH 6.5 和65℃條件下反應，每分鐘水解相應底物pNPR 釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

酶活力計算公式（U/mL）= c×V1/（t×V2）×N

式中：c—由對硝基苯酚標準方程計算出的酶反應后的對硝基苯含量（μmol）；V1—反應體系總體積（mL）；t—酶與底物反應時間（min）；V2—反應體系中酶液的體積（mL）；N—酶液的稀釋倍數。

1.5.3 乙酸濃度測定方法

取2 mL 發酵液，在4℃、10 000 rpm 下離心1 min，取1 mL上清液于5 mL離心管中，再加入0.2 mL 50%硫酸和1 mL乙醚，混勻后獲得樣品，經0.22 μm的有機濾膜過濾到色譜瓶中，用氣相色譜儀檢測乙酸的濃度。氣相色譜方法：柱溫在70℃的初始溫度保持3 min，然后以每分鐘8℃的增量升至230℃，并保持3 min（30 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷倫）；載氣（N2）的流速為2 mL/min；前端檢測器（FID）的溫度為300℃；尾氣的流速為25.00 mL/min；H2流速為30.00 mL/min；空氣流速為400 mL/min[17]。

2 結果與討論

2.1 指數流加培養對重組大腸桿菌發酵產酶的影響

在指數流加培養中，大腸桿菌的比生長速率由限制性營養的進料速率決定[18]。當μ超過閾值時，過量的葡萄糖通常會迫使大腸桿菌通過PTA-ACKA 和POXB 合成途徑產生乙酸，但當μ 低于閾值時，就不會產生乙酸[19]。盡管氧化乙酸可以產生額外的ATP 來支持大腸桿菌的更快生長，但乙酸的過度積累對重組大腸桿菌生產TstRhaA有不利影響。因此，減少乙酸形成和增加大腸桿菌生物量的最佳方法是調整比生長速率，這有利于增加重組蛋白的表達[14]。

從圖1a 中可以看出，當比生長速率為0.1 h-1時，乙酸含量開始迅速下降，誘導后最終濃度約為0 g/L，這可能是因為補充的碳源低于一定的閾值。此外，發酵17 h時，大腸桿菌的生物量（0.1 h-1）達到最大值，然后生物量緩慢下降，這表明大腸桿菌開始老化和死亡。結果表明，在0.1 h-1的低比生長速率下，補充的營養物質不能滿足其自身生長的需要，并且菌株在發酵后期缺乏生長。當比生長速率為0.2 h-1時（圖1b），誘導后乙酸含量開始逐漸降低，乙酸的終濃度為2.56 g/L，TstRhaA的最高活性達到306.5 U/mL，干細胞重量（DCW）為45.2 g/L。盡管乙酸的濃度保持在相對較高的水平，但它減緩了大腸桿菌的生長，并間接促進了大腸桿菌增加TstRhaA 的產量。當比生長速率為0.3 h-1時（圖1c），在誘導發酵最后，發酵液中的乙酸含量高于3.2 g/L。這是因為好氧發酵中碳源的補充超過了細胞生長的要求，導致培養物中大腸桿菌產生過量的乙酸，從而抑制了細胞生長和TstRhaA的產生。實驗結果表明，乙酸的產生對大腸桿菌的細胞生長和重組α-L-鼠李糖苷酶蛋白的產生有極其不利的影響，不同比生長速率的指數補料可以明顯調節乙酸的積累。

圖1 不同比生長速率的指數流加培養對重組大腸桿菌高密度發酵產酶的影響Fig.1 Effect of exponential fed-batch with different specific growth rates on the enzyme production of recombinant E.coli by high-density fermentation

2.2 兩階段指數流加培養對重組大腸桿菌發酵產酶的影響

為了實現大腸桿菌的高密度培養和重組耐熱TstRhaA 的大量生產，我們采用了基于比生長速率和誘導后葡萄糖殘余量的兩階段葡萄糖補料策略來控制菌體生長和乙酸形成[16，20]。在誘導前階段，按照指數補料速率，使菌體以0.2 h-1的比生長速率生長。當發酵培養8 h 時，加入IPTG 進行誘導，并基于梯度遞減方法改變補料速率。當μ′set為0.14 h-1時（圖2a），發酵后期的DCW 和乙酸含量迅速下降，這可能是有限的碳源無法支持大腸桿菌正常生長的主要原因。當μ′set為0.16 h-1時（圖2b），在誘導結束后，盡管大腸桿菌產生的乙酸濃度低于0.9 g/L，DCW 達到52.4 g/L，但最高酶活性僅為286.2 U/mL。當μ′set為0.18 h-1時（圖2c），乙酸濃度保持在1.6 g/L 左右，DCW 僅有44.3 g/L，比μ′set為0.16 h-1時降低了8.1 g/L，但最高酶活為364.8 U/mL，其是μ′set為0.16 h-1時的1.27倍，是搖瓶培養的14.5倍。結果表明：在誘導后期，乙酸的積累隨著μ′set的梯度增加而增加；在微生物發酵過程中，不同誘導前和誘導后比生長速率的指數流加培養可以很好地控制乙酸的積累。

圖2 兩階段不同比生長速率指數流加培養對重組大腸桿菌高密度發酵產酶的影響Fig.2 Effect of exponential fed-batch with two-stage specific growth rate on the enzyme production of recombinant E.coli by high-density fermentation

2.3 誘導溫度對重組大腸桿菌發酵產酶的影響

一般來說，誘導溫度是通過控制重組大腸桿菌的生長速率和代謝速度來調節乙酸的關鍵參數。研究表明，低溫通常可以防止重組蛋白的錯誤折疊，并增加大腸桿菌中的正確表達[21]。因此，在上述最優條件的基礎上，研究了不同誘導溫度對TstRhaA 產量的影響。研究結果如圖3所示：當誘導溫度過低時，TstRhaA的酶活力和DCW 均較低，這是因為低溫下重組大腸桿菌的生長受到影響，從而影響了TstRhaA 的產量。當誘導溫度為33℃時，TstRhaA 的酶活力是最高的，達到468.5 U/mL，是在30℃誘導下的1.6 倍；乙酸含量是最低的，只有1.3 g/L，是在30℃誘導下的72%；DCW 是最高的，達到49.5 g/L，是在30℃誘導下的1.31 倍。當誘導溫度為37℃和42℃時，TstRhaA 的酶活力和DCW 均逐漸降低，而乙酸含量顯著升高，這是因為高溫加速了細胞的代謝轉移，并在恒定的溶氧水平下快速積累乙酸，從而抑制了大腸桿菌的生長和TstRhaA的產生。這些結果表明：在高密度發酵過程中，低溫雖然可以防止重組蛋白的錯誤折疊，但是溫度太低會影響菌體生長速率，從而影響TstRhaA 的酶產量；TstRhaA 的酶活力和DCW 與乙酸含量呈負相關；適當的誘導溫度可以控制乙酸的積累，并提高耐熱酶的產量。

圖3 誘導溫度對重組大腸桿菌高密度發酵的影響Fig.3 Effect of induction temperature on high-density fermentation of recombinant E.coli.

2.4 誘導pH對重組大腸桿菌發酵產酶的影響

很多研究較少關注酸度或堿度對高密度培養過程中大腸桿菌產生的乙酸積累的影響[22-23]。pH 的影響是復雜的，它與其他條件有關，如DO、生長階段和大腸桿菌自身代謝變化等[24]。發酵液的酸堿度通常被誤認為是保證適宜細菌生長的酸堿度條件，而忽略了pH 對乙酸形成的調節作用。在誘導前的pH（pH 7.0）不改變的情況下，本文研究了在誘導后階段通過梯度遞減法調節誘導pH 獲得乙酸的最適pH，如圖4所示，當誘導pH 為7.2時，DCW達到69.6 g/L，TstRhaA的酶活力為589.0 U/mL，達到了最高水平，與搖瓶培養相比提高了23.4 倍。此時，乙酸的濃度被進一步控制到非常低的水平，一直保持在0.8 g/L 以下，與其他誘導pH 相比處于最低水平，其可能原因是培養基中的乙酸變為銨鹽，并且代謝成分抑制乙酸的形成[25]。但是當誘導pH為7.4時，乙酸含量顯著提升，可能的原因是高pH 誘導大腸桿菌的代謝酶參與精氨酸和谷氨酸的分解代謝途徑，將碳轉化為酸，而不是產生堿性胺[23]。研究結果表明，在誘導后階段通過調整誘導pH能夠實現對乙酸的調控；適當的pH不僅可以加速細菌的生長，而且可以調節和控制乙酸的形成。

圖4 誘導pH對重組大腸桿菌高密度發酵的影響Fig.4 Effect of induction temperature on high-density fermentation of recombinant E.coli.

3 結論

本文研究了指數流加培養、兩階段指數流加培養、誘導溫度、誘導pH對重組大腸桿菌發酵產酶的影響，研究結果表明，在發酵過程中通過調節乙酸的積累能夠顯著提升酶的產量。最終確定了最佳發酵工藝：誘導前比生長速率0.2 h-1，誘導后比生長速率0.18 h-1，誘導溫度33℃，pH 7.2。在最佳發酵工藝條件下，乙酸濃度始終保持在0.8 g/L 以下，DCW 最大為69.6 g/L，最高酶活力為589.0 U/mL，是搖瓶發酵的23.4 倍，最終實現了重組大腸桿菌高密度發酵生產TstRhaA。