木犀草素對(duì)D-半乳糖所致小鼠認(rèn)知障礙的改善作用*

李斯盛，蘭睿，譚淇，賈欣怡，熊煒，羅玥佶，曾杰

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219 ）

隨著人口老齡化加劇，阿爾茨海默病的患病率逐漸增高，給老年人及其家庭帶來(lái)精神痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］，抗衰老，防癡呆，已成為醫(yī)學(xué)界乃至整個(gè)社會(huì)的研究熱點(diǎn)。衰老導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)與功能的改變，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的減退［1-3］，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致癡呆。衰老導(dǎo)致的認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究表明神經(jīng)炎癥在其發(fā)病及進(jìn)展中起重要作用。目前，西藥治療認(rèn)知障礙存在許多問(wèn)題，迫切需要尋找新的藥物。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有抗感染、抗氧化等多種藥理學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于修復(fù)氧化應(yīng)激損傷，抑制神經(jīng)元凋亡等臨床應(yīng)用中［4-6］。本研究擬通過(guò)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等實(shí)驗(yàn)，觀察木犀草素對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為木犀草素用于臨床改善學(xué)習(xí)記憶提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及D-半乳糖皮下注射法建立衰老小鼠模型

購(gòu)買的小鼠通過(guò)Morris 水迷宮的初次篩選，將篩選合格的30 只小鼠［湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004］適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，分為3 組，每組10 只。分別是正常組、模型組、木犀草素（60 mg/kg）組。除正常組外，其它各組均頸后部皮下注射D-半乳糖（120 mg/kg）；同時(shí)灌胃給藥，正常組、模型組給予生理鹽水、木犀草素組每天按120 mg/kg 給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前8 d 進(jìn)行水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 測(cè)定SOD、MDA 的活力

模型建立成功后，尾靜脈取血，按試劑盒說(shuō)明書，羥胺法測(cè)定血清中超氧化物歧化酶（SOD）的活力、比色法測(cè)定血清中丙二醛（MDA）的活力。

1.3 免疫熒光染色

各組均隨機(jī)選取6 只小鼠，腹腔注射（i.p.）給予水合氯醛40 mg/kg 深度麻醉。4%多聚甲醛灌注，取材海馬，組織經(jīng)脫水，透明，浸蠟制成蠟塊，每組六張切片，按試劑盒添加相應(yīng)抗體進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用熒光顯微鏡，在高倍顯微鏡下，觀察NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞并拍照。

1.4 水迷宮檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)前1 d，讓小鼠在水迷宮中自由游泳以適應(yīng)環(huán)境。隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)置于第I 象限中央，訓(xùn)練時(shí)將小鼠從同一位置面向池壁放入水中，記錄小鼠游泳的平均速度及逃避潛伏期，此實(shí)驗(yàn)在第1～4 日進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠入水點(diǎn)次序保持一致。空間探索實(shí)驗(yàn)：每天的隱蔽和反向?qū)嶒?yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái)，選取第Ⅱ象限為入水點(diǎn)，游泳時(shí)間為60 s，記錄小鼠在原平臺(tái)處的穿越次數(shù)，此實(shí)驗(yàn)在第2～7 日進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用Post Hoc Tests 進(jìn)行。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素對(duì)衰老小鼠活動(dòng)度和新事物分辨指數(shù)的影響

單因素方差分析顯示，各組小鼠活動(dòng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.776,P＞0.05），各組間舔糖時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.25,P＜0.001），見(jiàn)圖1。與正常組［（41.22±10.68）%］比較，模型組［（-4.282±16.34）%］小鼠的新事物辨別指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），木犀草素組［（18.43±21.67）%］小鼠的新事物分辨指數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 木犀草素對(duì)衰老小鼠活動(dòng)度和新事物分辨指數(shù)的影響

2.2 木犀草素對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

Morris 水迷宮探索結(jié)果如表1 所示。與正常組相比，模型組、木犀草素組小鼠潛伏期明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，木犀草素組小鼠潛伏期均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組小鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與正常組比較，模型組小鼠在原平臺(tái)處的穿越次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），木犀草素組停留時(shí)間高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 木犀草素對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（n=10,,s）

表1 木犀草素對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（n=10,,s）

注：1）與正常組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

2.3 木犀草素對(duì)衰老小鼠SOD、MDA 含量的影響

通過(guò)試劑盒檢測(cè)各組小鼠海馬組織中SOD、MDA 含量，結(jié)果顯示與正常組比較，模型組SOD含量降低，MDA 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素組SOD 含量升高，MDA 含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 木犀草素對(duì)衰老小鼠SOD、MDA 含量的影響（n=10,）

表2 木犀草素對(duì)衰老小鼠SOD、MDA 含量的影響（n=10,）

注：1）與正常組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

2.4 木犀草素對(duì)各組小鼠NeuN 表達(dá)的影響

單因素方差分析顯示，各組小鼠海馬CA3 區(qū)NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.24，P＜0.001）。模型組小鼠NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目（170.70±22.34）明顯少于正常組（234.70±35.93），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；木犀草素組小鼠NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目（240.00±33.75）明顯多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 木犀草素對(duì)衰老小鼠NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的影響

2.5 木犀草素對(duì)小鼠海馬突觸蛋白的影響

WB 檢測(cè)條帶及分析如圖3 所示。單因素方差分析表明各組小鼠突觸核蛋白（Syn）的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.98,P＜0.05），正常組小鼠Syn的表達(dá)相對(duì)值為（1.084±0.223），模型組小鼠Syn的表達(dá)（0.54±0.122）低于正常組，木犀草素組小鼠Syn 的表達(dá)（0.65±0.359）高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 木犀草素對(duì)小鼠海馬突觸蛋白的影響免疫印跡分析圖

單因素方差分析表明各組小鼠突觸后密度蛋白-95（PSD-95）的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.684，P＜0.05），正常組小鼠PSD-95 的表達(dá)相對(duì)值為（1.003±0.348），模型組小鼠PSD-95 的表達(dá)（0.283±0.064）低于正常組，木犀草素組小鼠PSD-95 的表達(dá)（0.963±0.268）高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

阿爾茨海默病病因及機(jī)制復(fù)雜，病因?qū)W說(shuō)主要有遺傳控制說(shuō)、自由基損傷說(shuō)等［7-9］。其中，自由基損傷說(shuō)是具有代表性的學(xué)說(shuō)［10］。過(guò)剩的自由基會(huì)引發(fā)一系列毒性反應(yīng)，加速各器官衰老的速度。基于這種機(jī)制的研究，最常用的模型是D-半乳糖導(dǎo)致的衰老動(dòng)物模型，該模型與自然衰老較為相似［11］。本研究結(jié)果顯示，D-半乳糖注射后，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力并未明顯改變，但是其新舊食物識(shí)別指數(shù)明顯降低，表明該模型建立成功，D-半乳糖致衰老小鼠認(rèn)知能力下降。進(jìn)一步檢測(cè)各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了小鼠找到平臺(tái)的潛伏期和目標(biāo)象限停留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖注射后延長(zhǎng)了小鼠找到平臺(tái)的潛伏期，降低了小鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間，提示D-半乳糖注射損害了小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］。

SOD 和MDA 是反映機(jī)體氧化還原清除氧自由基能力的主要標(biāo)志物［13］。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠SOD 含量降低，MDA 含量升高，提示模型組小鼠清除氧自由基能力下降。進(jìn)一步檢測(cè)表明模型組小鼠海馬成熟神經(jīng)元數(shù)目降低，突觸相關(guān)蛋白表達(dá)下降，均提示D-半乳糖可能通過(guò)減弱氧自由基清除能力，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，神經(jīng)突觸可塑性減弱，從而導(dǎo)致小鼠認(rèn)知障礙。

目前，臨床治療阿爾茨海默病的一線藥物主要是改善膽堿系統(tǒng)功能的藥物和N-甲基-D-天氡氨酸（NMDA）受體拮抗劑。這些藥物對(duì)治療中、晚期阿爾茨海默病難見(jiàn)療效，且有胃腸道及心血管方面的不良反應(yīng)［14］。本研究表明，木犀草素能提高D-半乳糖致衰老模型小鼠新舊食物識(shí)別指數(shù)，減少定向航行潛伏期，增加探索能力，提示木犀草素能改善小鼠認(rèn)知能力。進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，木犀草素能增加衰老模型小鼠SOD 含量，降低MDA 含量，保護(hù)小鼠海馬成熟神經(jīng)元，并增加突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述，木犀草素可能通過(guò)增強(qiáng)氧自由基清除能力，保護(hù)海馬神經(jīng)元，增強(qiáng)神經(jīng)突觸可塑性，從而改善D-半乳糖導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知障礙，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。