和樞消積方通過調(diào)節(jié)AsTP3正反饋AKT/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

李 玲 汪 靜 朱曉寧 張玉蓉 尹 玥

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽病科 (四川 瀘州,646000)

原發(fā)性肝癌(PLC)是世界上第六大最常見的癌癥,發(fā)病率位居位世界癌癥第五,死亡率第三(約8.3%)[1]。目前對(duì)于PLC的治療手段主要包括手術(shù)、介入、放化療及靶向藥物,其中手術(shù)為治療早期PLC最常用的方法,但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率達(dá)70%,且本病起病隱匿,約60%以上的PLC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[2,3],因此,迫切需要探索和發(fā)現(xiàn)新的PLC治療藥物。本課題組前期的臨床研究發(fā)現(xiàn),和樞消積方能夠延緩PLC進(jìn)程,提高PHC患者生存率。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和樞消積方可以下調(diào)三氧化二砷反式激活蛋白3(AsTP3)表達(dá),結(jié)合前期研究,過表達(dá)AsTP3可以上調(diào)肝癌細(xì)胞中蛋白激酶B(AKT)表達(dá),下調(diào)AKT可以抑制糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活,抑制肝癌細(xì)胞增殖[4,5]。故推測(cè)和樞消積方抗癌作用與AsTP3及AKT/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路相關(guān),本研究將對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 和樞消積方(柴胡、黃芩、黃芪等)組方藥物經(jīng)10倍于藥物總質(zhì)量的蒸餾水加熱回流提取2次,每次1 h,合并提取的藥液,水浴濃縮,配制成相當(dāng)于生藥濃度1 μg/ml的藥液,0.22 μm微孔濾器過濾除菌備用,用DMEM培養(yǎng)基稀釋為需要的濃度使用,所有藥物均來自于西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科。人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞株為西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)gibco公司,胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司,CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司,Martige基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司,無氯仿RNA提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)百泰克生物技術(shù)有限公司,逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司,Bcl2、Bax、P-GSK-3β、GSK-3β抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司,GAPDH、P-AKT、AKT、P-mTOR、AsTP3抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,mTOR抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、goat anti-rabbit IgG、Anti-Mouse IgG均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司,引物由上海生工生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.2 藥物濃度篩選及細(xì)胞增殖活力測(cè)定 將SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板,24 h后加入和樞消積方干預(yù)。按照CCK8試劑盒說明書以每孔10 μl CCK8試劑混合完全培養(yǎng)基加入96孔板中,37℃孵育1 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A值)。篩選出最佳藥物濃度(18 μg/ml),并根據(jù)最佳藥物濃度的1/2、1/4設(shè)置中、低劑量組。測(cè)試不同藥物濃度梯度24 h、48 h、72 h細(xì)胞活力。

1.3 平板克隆實(shí)驗(yàn) 將SMMC-7721細(xì)胞按照3 000～5 000個(gè)/孔接種于6孔板中,24 h后予以不同濃度的藥物干預(yù),每2～3 d更換1次培養(yǎng)基,當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí)終止克隆,PBS清洗1次,甲醇固定30 min,0.5%結(jié)晶紫溶液染色20 min,拍照記錄。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將SMMC-7721細(xì)胞接種于12孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿,不同濃度藥物干預(yù)24 h后,細(xì)胞內(nèi)做直線劃痕,PBS清洗,更換無血清培養(yǎng)基,觀察24 h、48 h及72 h細(xì)胞愈合情況,并拍照記錄。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 按照Matrigel基質(zhì)膠說明書,將基質(zhì)膠加入Transwell小室中,放入孵箱中孵育1 h,待基質(zhì)膠凝固后取出。將經(jīng)不同濃度藥物干預(yù)后的SMMC-7721細(xì)胞按照1×105/ml密度,用無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液加入上室中,下室加入600 μl含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,放入孵箱,24 h后取出,熒光倒置顯微鏡拍照、記錄。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 除未在上室中加入基質(zhì)膠,余操作同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.7 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 不同濃度藥物干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞48 h,1 000×g離心5 min,PBS洗滌2次,使用Annexin V-FITC試劑盒,上流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析,每個(gè)樣品至少分析1×105個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率(%)=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。

1.8 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)總RNA試劑盒操作說明書提取細(xì)胞RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照qRT-PCR試劑盒說明書檢測(cè)基因AsTP3的表達(dá),結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.9 Western-Blot實(shí)驗(yàn) 不同藥物濃度干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞48 h后提取總蛋白,按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。99℃變性10 min后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影。

2 結(jié)果

2.1 和樞消積方對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 隨著和樞消積方藥物濃度增大,SMMC-7721細(xì)胞活性逐漸降低,當(dāng)藥物濃度大于30 μg/ml時(shí),與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);再次篩選,當(dāng)藥物濃度為18 μg/ml時(shí),與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。故本實(shí)驗(yàn)選用18 μg/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。予以和樞消積方分別干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h,與對(duì)照組相比,和樞消積方可以顯著降低SMMC-7721細(xì)胞活力,其中24 h、48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),72 h僅高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,低劑量及中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,隨著藥物濃度增加,細(xì)胞形成的集落顯著減少(圖3);同時(shí),和樞消積方可上調(diào)Bax蛋白及下調(diào)Bcl2蛋白的表達(dá)(圖4)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01

與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

2.2 和樞消積方對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲、遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,隨著藥物濃度增加,SMMC-7721細(xì)胞劃痕愈合能力逐漸降低,其中,高劑量組與對(duì)照組相比,具有顯著差異見圖5。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,和樞消積方干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24 h后,與對(duì)照組相比均能抑制SMMC-7721細(xì)胞的侵襲及遷移能力,且呈劑量依賴性見圖6。

與對(duì)照組比較,*P<0.05。

圖6 和樞消積方對(duì)SMMC-7721細(xì)胞侵襲與遷移的影響(結(jié)晶紫染色,200×)

2.3 和樞消積方對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,和樞消積方能明顯促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,其中中劑量組及高劑量組凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。見圖7。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

2.4 和樞消積方對(duì)SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)ASTP3基因與蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示和樞消積方能抑制SMMC-7721細(xì)胞AsTP3表達(dá)。見圖8。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

2.5 和樞消積方對(duì)SMMC-7721細(xì)胞AKT/GSK-3β/mTOR蛋白表達(dá)影響 不同濃度和樞消積方干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞均能下調(diào)其P-AKT、P-GSK-3β、P-mTOR蛋白的表達(dá)。見圖9。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,#P<0.01。

3 討論

肝細(xì)胞癌在傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中名為“積聚”“癥瘕”,中醫(yī)認(rèn)為其主要病機(jī)為“肝脾受損,氣機(jī)阻滯,瘀血內(nèi)結(jié)”形成腹內(nèi)結(jié)塊,導(dǎo)致積聚。和樞消積方是傳承全國(guó)名老中醫(yī)孫同郊教授經(jīng)典思想,由汪靜教授總結(jié)得出,其中柴胡疏肝理氣,黃芩清泄邪熱,二者配伍,為小柴胡之意,調(diào)和少陽樞機(jī),黃芪健脾益氣,顧護(hù)后天之本,諸藥配伍,使氣機(jī)調(diào)暢,肝胃調(diào)和,脾氣得健,濕熱清利,癥積自消。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)和樞消積方中柴胡、黃芩發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用,能調(diào)控癌細(xì)胞凋亡、增殖,達(dá)到抗癌目的[6,7]。同時(shí),課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)和樞消積方在延長(zhǎng)肝癌患者生存期方面有顯著作用。本研究通過CCK8法、平板克隆、劃痕、侵襲及遷移等實(shí)驗(yàn)表明,和樞消積方可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示和樞消積方能夠促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡。CCK8實(shí)驗(yàn)中,不同藥物濃度干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞72 h后,低劑量及中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮與細(xì)胞密度相關(guān)。Bax及Bcl2是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子,可以激活線粒體外膜透化,產(chǎn)生半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞不可逆的死亡[8]。和樞消積方能夠上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞中Bax蛋白、下調(diào)Bcl2蛋白表達(dá),提示和樞消積方促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡可能與介導(dǎo)線粒體外膜透化相關(guān),后期可開展進(jìn)一步研究。

AsTP3是2004年應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)克隆并鑒定的新基因,是一種膠原特異性分子伴侶,它在GeneBank中的別名還有SERPINH1、HSP47等,該基因位于人類癌癥中最常擴(kuò)增的區(qū)域之一—11q13.5號(hào)染色體上[9,10]。ENCORI(Encyclopedia of RNA Interactomes,RNA相互作用百科全書http://starbase.sysu.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫表明與正常肝組織相比,AsTP3在肝癌組織中呈高表達(dá)水平,且AsTP3高表達(dá)組生存期較低表達(dá)組生存期短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。本研究顯示,和樞消積方干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞能顯著下調(diào)AsTP3 mRNA及蛋白水平,故和樞消積方可能通過抑制AsTP3表達(dá)促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它為磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的主要下游效應(yīng)物,磷酸化的AKT與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等相關(guān),其過表達(dá)是抗腫瘤藥物治療靶點(diǎn)之一[11];AKT作為一種致癌蛋白,能被Thr38或Ser473磷酸化激活,從而激活其下游分子,如磷酸化的GSK-3β及Bcl2相關(guān)啟動(dòng)子,導(dǎo)致Bcl2在線粒體膜上解離,繼而抑制細(xì)胞凋亡[12,13]。有研究報(bào)道指出,AKT對(duì)GSK-3β活性的抑制可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡[14];PI3K/Akt信號(hào)通路可以通過調(diào)控下游哺乳動(dòng)物mTOR,促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15,16],磷酸化的mTOR可以通過Ser473和SGK1(S422)直接激活A(yù)KT,調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示和樞消積方可下調(diào)人SMMC-7721細(xì)胞中P-AKT、P-GSK-3β及P-mTOR蛋白水平,故認(rèn)為和樞消積方促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡機(jī)制與AKT/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路相關(guān)。研究顯示AsTP3在口腔癌中呈高表達(dá),加入PI3K抑制劑能下調(diào)AsTP3表達(dá)[18],且過表達(dá)AsTP3能上調(diào)P-Akt、沉默結(jié)果與之相反[5]。故認(rèn)為和樞消積方抗癌及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用可能與通過靶向AsTP3抑制AKT/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路有關(guān),但其如何調(diào)控AsTP3及具體作用位點(diǎn)尚未明確,不排除還存在其他信號(hào)通路協(xié)同抗癌。

綜上,本研究為和樞消積方的臨床運(yùn)用提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ),為中醫(yī)治療SMMC-7721提供了新思路,但本研究?jī)H從細(xì)胞分子層面證明,尚缺乏動(dòng)物研究論證,仍需進(jìn)一步探討和樞消積方如何下調(diào)AsTP3表達(dá)抑制AKT/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路。已有研究表明,AsTP3與鈣網(wǎng)蛋白及折疊蛋白相結(jié)合,可以增加癌細(xì)胞的化療藥物抗耐藥性[19],這為我們后續(xù)研究提供了新思路。