基于網絡藥理學和分子對接技術探討芪術肺纖湯治療特發性肺間質纖維化的作用機制Δ

張雯靜,王秋銘,李 萌,劉世剛,高 揚,李 輝,李國勤

(中國中醫科學院廣安門醫院呼吸科,北京100053)

特發性肺間質纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是以進行性肺纖維化為特征的間質性肺炎,臨床多表現為喘息氣短、干咳和活動后呼吸困難等,常伴有不可逆的肺功能喪失,病因不明,預后不良[1]。IPF患者確診后的中位生存期僅有3～5年,發病率隨年齡增長而升高[2]。目前,西醫主要采用抗纖維化藥物、糖皮質激素和免疫抑制劑等延緩疾病進展,不良反應大[3-4]。中醫辨證施治IPF,可有效改善臨床癥狀,提高患者生活質量。李國勤教授為我院首都名中醫,對中醫辨治IPF有獨到見解,李教授認為IPF患者以氣虛絡痹為基本病機,本在肺脾不足,宗氣虧虛,結局為久病及腎,痰瘀阻滯肺絡貫穿始終,治療應以補氣通絡為主[5-6]。芪術肺纖湯是李教授多年治療IPF的經驗所集,由黃芪、紅景天、苦杏仁、黨參、全蝎、莪術、黃精和巴戟天8味藥組成,具有補益肺脾腎、化瘀祛痰的功效。前期臨床研究結果證明,芪術肺纖湯可改善并延緩IPF患者的肺功能損害,減輕喘息咳痰等癥狀,增加運動耐量,改善患者生活質量[7-8]。但至今其藥理作用機制尚未完全闡明,因此,從分子角度探索芪術肺纖湯治療IPF的藥理作用機制是非常必要的。本研究擬采用網絡藥理學方法和分子對接技術分析芪術肺纖湯治療IPF的作用機制,以期為臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 獲取芪術肺纖湯活性成分及靶點

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索芪術肺纖湯活性成分及靶點,利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)進行標準化處理;對于未檢索到的全蝎和紅景天,采用BATMAN數據庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)、中醫藥百科全書數據庫(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)和本草組鑒數據庫(http://herb.ac.cn/)獲取活性成分后合并去重,通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取對應的Canonical SMILES號上傳至Swiss Target Prediction數據庫(http://swisstargetprediction.ch/),研究物種選取“Homo sapiens”,條件設為“Probability>0”進行靶點預測,剔除無化學結構和無靶點者,將所有數據合并即為芪術肺纖湯的活性成分及靶點。

1.2 獲取IPF疾病靶點

以“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”為關鍵詞,“Homo Sapiens”為目標物種,檢索GeneCards(https://genealacart.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、人類孟德爾遺傳綜合數據庫(OMIM,https://omim.org/)和DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/),獲取IPF疾病靶點。

1.3 獲取芪術肺纖湯治療IPF的核心靶點及PPI網絡圖

利用Venny 2.1.0在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將芪術肺纖湯與IPF靶點取交集并繪制韋恩圖,導入STRING數據庫(https://string-db.org),以“Homo Sapiens”為物種獲得蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)關系,以“≥2倍的度值中位數”為條件利用Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/download.html)篩選得到芪術肺纖湯治療IPF的核心靶點,繪制PPI網絡圖。

1.4 建立中藥-成分-靶點-疾病網絡圖

篩選前30位核心靶點及對應成分,以節點表示中藥成分、靶點、藥物、方劑和疾病,邊表示節點之間的相互關系,導入Cytoscape軟件,構建中藥-成分-靶點-疾病圖。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)和Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,分別篩選P值排序居前10位的GO-生物過程(BP)、GO-分子功能(MF)和GO-細胞組成(CC)富集結果及排序居前20位的KEGG富集結果,采用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)制成柱狀圖進行可視化。

1.6 建立中藥-成分-靶點-疾病-通路網絡圖

將前30位核心靶點、活性成分、藥物、方劑、疾病、通路信息導入Cytoscape軟件,構建中藥-成分-靶點-疾病-通路圖。

1.7 分子對接

篩選度值排序居前10位的核心靶點,通過反向分子篩選對應活性成分,利用TCMSP數據庫獲取mol2格式的活性成分3 D結構,未檢索到3 D結構者通過PubChem數據庫獲取sdf格式,通過Open Babel GUI軟件(http://openbabel.org/wiki/Category:Installation)轉換為mol2格式;通過PDB蛋白質在線數據庫(https://www1.rcsb.org/)下載前10位核心靶點的蛋白質結構,使用Autoduck vina軟件(https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/)將靶點和活性成分虛擬對接,使用Pymol軟件(https://pymol.org/2/)進行可視化圖形展示。分子虛擬對接結合能<-17.77 kJ/mol,表示具有一定的結合活性,<-20.90 kJ/mol表示結合活性較好,<-29.26 kJ/mol表示結合效能更佳[9]。

2 結果

2.1 芪術肺纖湯活性成分及靶點

共獲得芪術肺纖湯活性成分445個,對應靶點基因4 705個。其中,黃芪活性成分51個,靶點756個;紅景天活性成分25個,靶點616個;苦杏仁活性成分76個,靶點780個;黨參活性成分86個,靶點740個;全蝎活性成分5個,靶點170個;莪術活性成分60個,靶點507個;黃精活性成分27個,靶點373個;巴戟天活性成分115個,靶點763個。

2.2 IPF疾病靶點

通過GeneCards數據庫獲得3 523個IPF疾病靶點,DisGeNET數據庫獲得734個靶點,Drugbank數據庫獲得39個靶點,OMIM數據庫獲得13個靶點,OMIM genemap數據庫獲得347個靶點,合并去重后共獲得IPF疾病靶點4 509個。

2.3 芪術肺纖湯治療IPF的核心靶點

共獲得456個交集靶點,篩選后得到101個核心靶點,可視化分析得出PPI網絡圖,見圖1。圖1中,靶點越大、顏色越深,表明節點度值越大,靶點越重要。度值排序居前10位的靶點有蛋白激酶B1(Akt1)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、人β-肌動蛋白(ACTB)、腫瘤蛋白p53(TP53)、白細胞介素1β(IL-1β)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、轉錄激活因子3(STAT3)、轉錄因子AP-1(JUN)和表皮生長因子受體(EGFR)。

圖1 芪術肺纖湯治療IPF核心靶點的PPI圖

2.4 中藥-成分-靶點-疾病圖

通過Cytoscape軟件構建中藥-成分-靶點-疾病網絡圖,表明芪術肺纖湯通過多成分、多靶點發揮對IPF的治療作用,見圖2。

紅色節點表示藥物名稱,深藍色節點表示方劑名稱,深紫色節點表示疾病名稱,橘黃色節點表示靶點,其余節點表示各個藥物的活性成分。

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

共獲取GO富集結果1 148個,其中GO-BP、GO-CC和GO-MF分別有735、155和258個;KEGG富集結果196個。前30位GO富集結果三合一柱狀圖見圖3;前20位KEGG結果柱狀圖見圖4。表明芪術肺纖湯通過多通路治療IPF,且磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路可能是涉及的最主要的信號通路,見圖5。因臨床對惡性腫瘤研究廣泛,PI3K-Akt通路又屬癌癥通路和脂質與動脈粥樣硬化通路范圍內,因此,KEGG結果中雖然癌癥通路和脂質與動脈粥樣硬化通路數量較多,但不具代表意義。

圖3 GO富集分析三合一柱狀圖

圖4 KEGG富集分析前20條通路柱狀圖

綠色矩形為未識別蛋白,紅色矩形為已識別蛋白。

2.6 中藥-成分-靶點-疾病-通路圖

利用Cytoscape軟件,構建中藥-成分-靶點-疾病-通路網絡圖,見圖6。

綠色節點代表核心靶點,橘紅色節點代表活性成分,粉色節點代表KEGG通路,藍色節點代表藥物,黃色節點代表方劑,紫色節點代表疾病。

2.7 分子對接結果

分子對接結果顯示,大部分活性成分均能與靶點蛋白結合良好,其中以熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素與TP53、TNF、Akt1、IL-1β、IL-6、VEGFA結合能力較強,結合能<-20.90 kJ/mol者見表1,部分結合能<-29.26 kJ/mol的分子對接結果可視化見圖7。

表1 芪術肺纖湯治療IPF的前10位核心靶點與活性成分的分子對接結果

玫紅色表示活性成分與靶點蛋白結合部分;黃色虛線表示連接氫鍵;白色表示殘基名稱。A.TP53-熊果酸;B.TP53-木犀草素;C.VEGFA-熊果酸;D.TNF-熊果酸;E.IL-1β-熊果酸;F.IL-6-熊果酸;G.TNF-芹菜素;H.Akt1-芹菜素;I.IL1β-槲皮素;J.Akt1-木犀草素;K.VEGFA-芹菜素;L.Akt1-山柰酚。

3 討論

IPF為現代醫學病名,中醫一般歸屬為“肺痹”“肺痿”“咳嗽”和“喘證”等范疇。李教授認為,“肺痹”多為結締組織病相關的間質性肺病,而IPF應屬中醫學“肺痿”范疇[10]。肺氣虧虛,復感外邪,肺失宣肅而發咳喘,氣病可及血,血病亦可及氣,正如《素問·調經論》中記載,“血氣不和,百病乃變化而生”。肺氣虛則肺絡血行不暢,凝而成瘀,故采用芪術肺纖湯,以黃芪、紅景天為君,補肺活血、化瘀通絡;瘀血停滯日久津液內停,化生痰濁,故臣以莪術活血祛瘀,全蝎搜風剔邪、活血通絡;苦杏仁祛痰止咳、降逆平喘,主入肺經,引諸藥直達病所;脾為生痰之源,肺為貯痰之器,肺病日久,致子盜母氣,脾土運化失調,水液停積則聚而生痰,故又以黨參為臣補肺健脾、益氣養血,通過健運后天之本,也可達到祛痰益氣的功效;痰瘀虛互結日久,病勢纏綿,可累及脾腎,更佐以黃精、巴戟天補益肺腎、健脾和胃,祛痰化瘀而不傷正,氣血調暢則病邪得解;全方補瀉共施,具有化瘀祛痰、補益肺脾腎的功效。

現代藥理學研究結果表明,黃芪可降低大鼠血清血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子(VEGF)水平,下調肺組織轉化生長因子(TGF)β1、Smad3以及TGF-β1 mNRA水平,改善肺纖維化[11];紅景天苷可下調Ⅰ型膠原蛋白、肌動蛋白和纖連蛋白等,防治TGF-β1誘導的人胚肺成纖維細胞纖維化改變[12];苦杏仁苷可調控TGF-β/Smad通路,降低Smad2和Smad3磷酸化水平,發揮抗肺纖維化作用[13];莪術醇可通過TGF-β1和纖溶酶原激活物抑制劑-1表達,降低羥脯氨酸含量,緩解博來霉素誘導的大鼠肺纖維化[14];黨參能抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠核因子κB(NF-κB)及相關炎癥介質表達,降低IL-6、IL-1β及IL-8水平[15],并可與活血藥配伍,發揮調節細胞外基質代謝、減輕炎癥反應等作用,來防治肺纖維化[16];文獻報道,蟲類藥如水蛭、蜈蚣和地龍可減少纖維蛋白沉積及炎癥細胞浸潤等[17],改善IPF患者的臨床癥狀[18],但關于全蝎治療IPF的藥理作用還有待研究;黃精可顯著降低血清IL-6、TNF-α及C反應蛋白含量,減輕肺氣虛炎癥狀態[19];巴戟天可通過促進單核細胞趨化蛋白-1、IL-8蛋白表達,調節免疫,減少機體有害反應[20],但其干預肺纖維化的藥理研究目前缺乏文獻報道。

本研究采用網絡藥理學方法篩選得到熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素和山柰酚等為芪術肺纖湯治療IPF的主要活性成分。研究結果表明,熊果酸可能通過抑制Toll樣受體4/NF-κB信號通路激活,抑制下游促炎癥細胞因子表達,減輕肺纖維化[21]。芹菜素可降低肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量及IL-6等炎癥因子含量,改善小鼠肺纖維化病理進程[22];木犀草素可抑制炎癥介質IL-1β、TGF-β1表達及NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體活化等,減輕肺部炎癥反應及纖維化[23];槲皮素通過抑制大鼠TGF-β1誘導的細胞間質轉化和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4-自噬蛋白信號途徑,激活自噬并減輕肺纖維化病變[24];山柰酚有抗炎、抗氧化應激等作用,可能與抑制氣道和肺實質炎癥反應有關[25],同時能顯著降低TNF-α、IL-6和IL-1β水平,有效減輕肺組織病理學變化[26]。上述活性成分通過抑制NF-κB信號通路和細胞間質轉化,降低IL-6、TNF-α等炎癥因子表達等發揮治療作用,這在PI3K-Akt信號通路中均有所體現。

根據PPI網絡分析結果,排序靠前的核心靶點有TP53、Akt1、TNF、1 L-1β、IL-6和VEGFA等,且均與主要活性成分結合良好,證實了芪術肺纖湯治療IPF的臨床療效。研究結果表明,P53蛋白的激活可誘導肺成纖維細胞衰老,進而加快肺纖維化進展[27];Akt1可調節肺部巨噬細胞中IL-13的表達,減緩肺纖維化發展[28];TNF-α能促進肺組織細胞外間質分泌及膠原纖維過度增殖,造成肺纖維化病理改變[29];IL-6是M1型巨噬細胞分泌的多效因子,可促進纖維化產生,研究結果表明,敲除IL-6基因可明顯抑制小鼠TGF-β1表達上調,發揮抗肺纖維化作用[30];VEGF可與血管內皮特異性受體結合,促進細胞增殖和血管新生,而大量無序的新生血管是纖維間隔形成的重要病理過程[31]。

富集分析結果表明,芪術肺纖湯主要影響炎癥反應、缺氧反應和基因表達正調控等BP;作用細胞外間隙、細胞膜和細胞質等CC;參與血紅素結合、蛋白質結合和轉錄因子結合等MF;KEGG可能涉及癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、晚期糖基化終末產物(AGE)-AGE受體信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化和TNF信號通路等,其中PI3K-Akt信號通路可能通過調控Akt1、TP53、NF-κB、P21和Bcl2等基因,促進糖原合成酶激酶3磷酸化,誘導原癌基因Myc的表達,也可能通過調節下游衰老相關蛋白P21的表達,影響細胞衰老進程,PI3K-Akt通路也將成為下一步深入研究的關注點。分子對接結果表明,熊果酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素與TP53、TNF、Akt1、1 L-1β、IL-6、VEGFA在芪術肺纖湯治療IPF中發揮重要作用,可為臨床研究中藥治療IPF提供思路和方向。

綜上所述,本研究采用網絡藥理學方法和分子對接技術,揭示了芪術肺纖湯多成分、多靶點、多通路治療IPF的作用機制,可為中醫藥治療IPF提供線索和證據支持。但本研究主要是從理論層面探討,后期還將開展實驗研究進一步驗證結果的準確性。