珍稀瀕危飄帶兜蘭葉綠體全基因組種內變異研究

高鑫禎 唐露 汪雨 邵士成 羅艷

摘 要： ???飄帶兜蘭 （Paphiopedilum parishii） 分布范圍狹窄，僅在中國、緬甸、泰國以及老撾有少量分布。近年來，因生境破壞和人為濫采而導致飄帶兜蘭野生種群極度縮減。為開發種內多態性的分子標記用于保護生物學研究，該研究對飄帶兜蘭4個野生個體經測序、組裝、注釋獲得的葉綠體基因組序列，與已公布的飄帶兜蘭2個個體的葉綠體全基因組序列進行比對，分析飄帶兜蘭葉綠體基因組的種內差異。結果表明：（1） 飄帶兜蘭葉綠體基因組具有典型被子植物葉綠體基因組環狀四分體結構，基因組長度為154 403～154 809 bp，共編碼129個基因，包括78個蛋白質編碼基因、39個tRNA基因、8個rRNA基因，以及4個假基因。（2） 在飄帶兜蘭6個個體葉綠體基因組中檢測到103～107個簡單重復序列 （simple sequence repeats，SSRs） 位點，其中21個SSR位點具有多態性。此外，在6個個體葉綠體基因組中還檢測到60個長序列重復，包括17～21個正向重復、18～29個反向重復、9～16個回文重復、4～9個互補重復。（3） 通過比較6個個體葉綠體基因組序列的核苷酸多樣性，共發現70處變異，包括10個單核苷酸多態性 （single nucleotide polymorphism，SNPs） 、60個插入缺失 （InDels）。其中，有3個SNP位點發生了非同義替換，導致編碼功能基因的氨基酸發生改變；19個插入缺失多態性較高，具有開發為分子標記的潛力。（4） 通過計算核苷酸多樣性值 （Pi） 共發現8個有變異的區域，Pi值為0～0.006 32，其中變異度較大的是rps3-rpl22、trnL-UAC-rpl32、rpoB-trnC-GCA以及ycf4，這些高變區可開發為分子標記用于評估飄帶兜蘭遺傳多樣性。（5） 系統發生分析結果表明，飄帶兜蘭6個個體葉綠體基因組序列聚在一起，與長瓣兜蘭互為姐妹群。綜上表明，飄帶兜蘭葉綠體基因組的SSRs、長序列重復、SNPs、[JP2]InDels以及核苷酸序列呈現了足夠的種內多樣性，可開發成分子標記用于該種的系統演化及保護生物學研究。

關鍵詞： ?葉綠體全基因組， 飄帶兜蘭， 序列差異， 多態性分子標記， 插入缺失， 微衛星

中圖分類號： ??Q943

文獻標識碼： ???A

文章編號： ??1000-3142（2024）01-0001-14

Intraspecific genetic variation within chloroplast

genome of a rare and endangered species

Paphiopedilum parishii （Orchidaceae）

GAO Xinzhen1，2， TANG Lu1， WANG Yu1，3， SHAO Shicheng1， LUO Yan1*

（ 1. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Mengla 666303， Yunnan， China; 2. University of Chinese Academy

of Sciences， Beijing 100049， China; 3. School of Landscape Architecture， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract： ??Paphiopedilum parishii is a rare and endangered species with few localities and fragmented populations found in China， Myanmar， Thailand and Laos. Environmental changes and over-harvesting have led to a decrease in its wild populations. It is important to protect endangered species genetic diversity since it provides the species with the ability to adapt and survive. However， little is known about the genetic information of this species. This study aims to detect intraspecific variation and develop polymorphic genetic markers of P. parishii. The complete chloroplast genome of four individuals of wild P. parishii was obtained by sequencing， assembling and annotating， then compared with the existing genomic data of two individuals available from GenBank to detect the intraspecific variation. Further， simple sequence repeats （SSRs）， single nucleotide polymorphisms （SNPs）， and insertions and deletions （InDels） were identified. The results were as follows： （1） The four new sequencing chloroplast genomes were quadripartite， with a length between 154 403 bp and 154 809 bp， with 129 genes （78 protein coding genes， 39 tRNAs， 8 rRNAs and four pseudogenes）. （2） As a result of comparison of six individuals， 103-107 SSR loci were identified in the chloroplast genome of six individuals of P. parishii， and 21 SSRs were polymorphic. And 60 long repeats were found， including 17-21 forward repeats， 18-29 reverse repeats， 9-16 palindromic repeats， and 4-9 complement repeats. （3） In addition， a total of 10 SNPs and 60 InDels were uncovered across the plastome. Three of the non-synonymous mutations caused amino acid changes in functional domains. 19 InDels might be selected for possible chloroplast DNA markers to determine intraspecific variation. （4） The value of nucleotide diversity （Pi） was calculated ranging from 0-0.006 32 suggesting sequences with low variation. Hyper-polymorphic regions， e.g. intergenic spacers rps3-rpl22， trnL-UAC-rpl32， rpoB-trnC-GCA and ycf4 gene were identified as potential barcoding regions. （5） The phylogenetic analyses based on the complete chloroplast genome supported three lineages in Paphiopedilum， and six individuals of P. parishii form a monophyletic group. SSRs， long repeats， InDels， SNPs and nucleotide sequences showed sufficient intraspecific genetic variation in P. parishii. The molecular markers developed here will contribute to further evolutionary studies and conservation of P. parishii.

Key words： ?chloroplast genome， Paphiopedilum parishii， sequence divergence， polymorphic DNA markers， InDels， SSRs

遺傳多樣性代表著物種適應環境和生存發展的能力，保存珍稀瀕危物種的遺傳多樣性是物種保護的重要目標 （Guerrant & Pavlik， 1998; 黃宏文， 2018）。葉綠體是植物細胞內進行光合固碳和脅迫應答的重要半自主遺傳細胞器，植物葉綠體基因組為環狀DNA分子，單親遺傳，基因組大小為107～218 kb，基因結構和組成穩定 （張韻潔和李德銖， 2011; Ivanova et al.， 2017）。葉綠體基因組通常為四分體結構，包括兩個反向重復序列（inverted repeat， IR）、一個大單拷貝區 （large single copy region， LSC） 和一個小單拷貝區 （small single copy region， SSC） （Wolfe et al.， 1987; 田欣和李德銖， 2002; Jansen et al.， 2005; 張韻潔和李德銖， 2011; He et al.， 2019）。葉綠體基因組編碼110～130個基因，主要包括光合作用相關和葉綠體基因表達相關的基因等 （張韻潔和李德銖， 2011）。葉綠體基因組雖然較小，但包含有大量遺傳信息，在核苷酸序列水平和結構重排上呈現出進化與保守性，編碼區和非編碼區有不同進化速率，在分子水平上有明顯差異，可用于區分種間關系、評估種間變異性等，被廣泛用于群體遺傳多樣性、系統演化等研究領域 （Wolfe et al.， 1987; 張韻潔和李德銖， 2011; He et al.， 2019; 黎若竹等， 2022）。近年來，利用種內不同個體葉綠體基因組的種內變異，為物種進化研究、種質資源利用以及瀕危植物保護提供了基礎遺傳信息（Ishizuka et al.， 2017; Muraguri et al.， 2020; Zhang RS et al.， 2020）。

兜蘭屬 （Paphiopedilum） 為蘭科（Orchi-daceae）杓蘭亞科 （subfamily Cypripedioideae）植物，有80余種，主要分布于亞洲至太平洋島嶼的熱帶亞熱帶地區的石灰巖山地 （Cribb， 1998; 劉仲健等， 2009）。兜蘭的唇瓣因形似拖鞋而被稱為“拖鞋蘭”，具有極高的觀賞價值 （楊穎婕等， 2021）。近年來，兜蘭屬植物的自然生境局限于生態環境脆弱的喀斯特地區，加上過度采挖等人類活動導致的生態退化和生境嚴重破壞，使得兜蘭屬植物野生種群數量急劇減少，部分兜蘭屬植物面臨野外滅絕的風險 （羅毅波等， 2003; 楊穎婕等， 2021）。目前，所有野生兜蘭種類均列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》 （Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora， CITES），同時我國分布的野生兜蘭屬植物也全部列入《國家重點保護野生植物名錄》（2021年9月頒布實施）。因此，我國野生兜蘭屬物種的瀕危機制與保護工作急需開展。

飄帶兜蘭 （Paphiopedilum parishii ）為附生蘭科植物，生于海拔1 000～1 100 m的樹干或石頭上，為我國一級重點保護植物。飄帶兜蘭被世界自然保護聯盟 （International Union for Conservation of Nature， IUCN） 評估為瀕危等級 （Endangered， ER），僅在中國云南南部、泰國、緬甸和老撾分布有少數的野生種群 （Rankou & Averyanov， 2015）。飄帶兜蘭具有極高的觀賞價值，在各植物園均有引種，但野生種群已極為罕見。Chen等 （2012） 在云南南部進行了飄帶兜蘭繁殖生物學的觀察，發現該種具有獨特的自動授粉機制。基于葉綠體全基因組發育基因組學的研究，飄帶兜蘭屬于兜蘭亞屬 （subgenus Paphiopedilum） （Guo et al.， 2021）。但是，有關飄帶兜蘭的遺傳信息仍不完善，缺乏評估遺傳多樣性及種內多樣性的分子標記，不利于對其開展綜合保護。

本研究選取飄帶兜蘭的4個野生個體進行淺層基因組測序、組裝獲得葉綠體全基因組，并與已公開的該種2個個體葉綠體基因組 （Guo et al.， 2021; Kao et al.， 2021） 進行基因組比較，分析飄帶兜蘭葉綠體基因組的種內變異，理解其基因進化水平和遺傳多樣性，以期開發種內多態性的分子標記用于保護生物學研究，為開展飄帶兜蘭的瀕危機制及物種保護研究提供遺傳信息基礎資料。

1 材料與方法

1.1 研究材料及DNA提取、測序

飄帶兜蘭4個個體分別采自云南省勐臘縣 （P. parishii_1 和P. parishii_2） 及瀾滄縣 （P. parishii_3 和P. parishii_4） 兩個野生居群 （圖1），取新鮮葉片放入硅膠中干燥。采用植物基因組DNA提取試劑盒 （TIANGEN， 中國北京） 提取葉片總DNA，使用IlluminaTruSeq文庫建立試劑盒 （San Diego， CA， USA） 構建測序文庫，利用Illumina Hiseq 2500測序平臺 （上海派森諾生物科技有限公司） 進行淺層基因組測序。同時，在GenBank上下載已公開的另外2個飄帶兜蘭個體的葉綠體基因組序列 （P. parishii_5， MW528213和P. parishii_6， MN587822）進行比較基因組分析。

1.2 葉綠體基因組的組裝和注釋

采用Fastp軟件對下機后的原始數據 （raw data） 進行過濾，獲得高質量測序數據 （clean data） 后，用GetOrganelle v1.6.3程序將測序后得到的數據組裝成葉綠體基因組 （Jin et al.， 2018）。組裝完成后的葉綠體基因組數據用Geneious Prime v2021.2.2的MAFFT工具進行比對后，使用在線工具CPGAVAS2 （http：//47.90.241.85：16019/analyzer/annotate2） （Shi et al.， 2019），GeSeq （https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html） （Tillich et al.， 2017） 和tRNA-scan-SE v2.0.3 （Lowe & Chan， 2016） 對葉綠體基因組的蛋白質編碼區、核糖體RNA （rRNA） 和轉運RNA （tRNA） 進行注釋，參考已發表的兜蘭屬葉綠體基因組對注釋結果進行校正。通過OGDRAW （https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw. html） 在線網站繪制飄帶兜蘭葉綠體基因組圖譜 （Lohse et al.， 2007）。使用Geneious Prime 2021.2.2軟件分析6個飄帶兜蘭葉綠體基因組的基本結構，統計LSC、SSC、IR的長度以及GC含量、蛋白質編碼基因、tRNA基因、rRNA基因的數目。

1.3 葉綠體基因組重復序列和SSR分析

通過MISA在線網站 （https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa） （Beier et al.， 2017） 測算葉綠體基因組中簡單重復序列 （simple sequence repeats， SSR） 的分布，將核苷酸最小重復數分別設置為10 （單核苷酸重復mononucleotide repeats）、5 （二核苷酸重復dinucleotide ?repeats）、4 （三核苷酸重復trinucleotide repeats）、3 （四核苷酸重復tetranucleotide ?repeats）、3 （五核苷酸重復pentanucleotide repeats）、3 （六核苷酸重復hexanucleotide ?repeats）。

通過REPuter （https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer） （Kurtz et al.， 2001） 在線網站測算葉綠體基因組中其他重復序列的分布，參數設置為最小重復序列30 bp，漢明距離（Hamming distance） 設置為3 （Liang et al.， 2019）。

1.4 種間葉綠體基因組的比較分析

通過mVISTA （https：//genome.lbl.gov/vista） 在線網站 （Frazer et al.， 2004），以P. parishii_1的葉綠體基因組作為參考，將其余5條飄帶兜蘭的葉綠體基因組的編碼區、基因間隔區、內含子區進行比對分析，評估各基因組序列之間的相似性和差異。使用R v4.0.2軟件運行IRscope （Amiryousefi et al.， 2018） 腳本，對6個個體的葉綠體基因組序列的相鄰邊界區域進行繪制，比較分析邊界區域的擴張和收縮情況。使用DnaSP v5.10.0.1軟件，統計飄帶兜蘭不同個體間序列的單核苷酸多態性 （SNPs） 和插入缺失 （InDels） 情況，計算各序列間核苷酸多樣性 （Pi）。

1.5 系統發育分析

從GenBank上下載15種兜蘭屬葉綠體全基因組序列，與本研究新測序拼裝的4個個體以及已發表的2條飄帶兜蘭葉綠體基因組序列，以3種杓蘭屬植物為外類群來構建系統發育樹 （物種的基因登錄號見圖5）。使用PhyloSuite v1.2.2軟件，利用ModelFinder計算最佳堿基替換模型 （Zhang et al.， 2020a），使用葉綠體基因組全序列，經MAFFT進行多序列比對后，采用IQ-TREE構建最大似然法 （maximum likelihood， ML） 系統發育樹 （Trifinopoulos et al.， 2016），系統發育樹分支的支持率基于bootstrap自展法檢測，將bootstrap值設置為5 000、重復次數設置為1 000次。

2 結果與分析

2.1 飄帶兜蘭葉綠體基因組基本特征

對原始數據進行過濾后，飄帶兜蘭4個樣品分別獲得2.4～3.1 G的高質量clean data。組裝和注釋的葉綠體全基因組序列已登錄至GenBank （登錄號為OP 604356～OP 604359）。將本研究獲得的飄帶兜蘭4個個體和已公布的2個飄帶兜蘭葉綠體基因組一起比對分析，發現6條序列的葉綠體基因組均為環狀四分體結構，包括LSC區、SSC區和2個IR區 （圖2）。葉綠體基因組序列全長為154 403～154 809 bp，其中LSC的長度為86 581～86 983 bp，SSC的長度為2 436～2 446 bp，IR的長度為32 690～32 693 bp。總GC含量為35.9%，LSC的GC含量為33.4%，SSC的GC含量為29.1%～29.2%，IR的GC含量為39.5% （表1）。

飄帶兜蘭6個個體葉綠體基因組的基因總數均為129個，包括78個蛋白質編碼基因、39個tRNA基因、8個rRNA基因，以及4個假基因 （ndhJ、ndhD、2個ycf15） （附表1）。22個基因在IR區重復，具有2個拷貝，包括9個蛋白質編碼基因 （psaC、ndhB、rps7、rps15、rps19、rpl2、rpl23、ycf1、ycf2）、9個tRNA基因 （trnA-UGC、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnL-UAG、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC） 和4個rRNA基因 （rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5）。18個基因有內含子，其中15個基因含有1個內含子，包括9個蛋白編碼基因 （petB、petD、atpF、ndhB、rpoC1、rps16、rpl2、rpl16、accD） 和6個tRNA基因 （trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC）；2個基因含有2個內含子 （clpP、ycf3）；rps12為反剪接基因 （附表1）。

2.2 SSR位點分析

利用MISA軟件在飄帶兜蘭6個個體的葉綠體基因組中分別檢測到103～107個SSR位點，包括47～51個單核苷酸重復 （主要以A、T堿基重復為主）、20個二核苷酸重復、15個三核苷酸重復、14個四核苷酸重復、2個五核苷酸重復和5個六核苷酸重復類型 （圖3： A；附表2）。SSR位點大部分位于LSC區 （84～88個），其次分布于IR區（18～19個），SSC區無SSR位點 （圖3： B）。另外，SSR位點主要分布于葉綠體基因組非編碼區的基因間隔區 （intergenic spacer， IGS），為72～76個；位于基因內含子區 （intron） 的有17個；位于編碼區的有14個（圖3： C， D）。

將飄帶兜蘭6個個體同源區域的SSR位點進行詳細的比對，篩選出具有相同類型且重復數目不同的SSR位點，可作為種內多態性位點，共發現21個SSR位點在6個個體中有差異 （表2）。

2.3 重復序列分析

利用REPuter對6條飄帶兜蘭葉綠體基因組序列進行重復序列分析。在6個葉綠體基因組中均鑒定到60個重復序列，包括17～21個正向重復（forward repeats）、18～29個反向重復（reverse repeats）、4～9個互補重復 （complement repeats）、9～16個回文重復 （palindromic repeats） （圖4： A）。6條葉綠體基因組重復序列的長度范圍雖然跨度較大，但都集中在30～40 bp之間 （圖4： B）。

2.4 飄帶兜蘭種間葉綠體基因組序列的多樣性

以P. parishii_1為參考序列，利用mVISTA軟件對6條飄帶兜蘭序列進行序列多樣性比較 （附圖1）。6條飄帶兜蘭序列相似性較高，LSC區的多樣性相對較高，略高于IR區和SSC區。多樣性水平較高的片段主要在非編碼區，如atpH-atpI、psaA-ycf3、atpB-rbcL、accD-psaI、trnP-UGG-psaJ。編碼區變異度較低，ycf1基因的變異度稍高，tRNA和rRNA基因在飄帶兜蘭中極為保守。

6條序列邊界比較圖（附圖2）顯示，rpl22、trnL-UAG、rps19以及psbA分別位于6條序列的LSC/IRb、IR/SSC、IRa/LSC邊界或邊界附近。rpl22位于LSC/IRb邊界上，有58 bp的片段位于IRb區域；重復基因trnL-UAG位于IR區域內，離IR/SSC邊界相距176～186 bp；重復基因rps19位于IR區，離IR/LSC邊界282 bp；psbA位于LSC區，離IRa/LSC邊界96 bp ?（附圖2），6條序列邊界基因較為保守，擴張收縮現象不顯著，僅P. parishii_4的IR區有微小擴張。

2.5 飄帶兜蘭種間葉綠體基因組核苷酸多樣性

通過對6條飄帶兜蘭葉綠體基因組核苷酸多樣性的分析，發現6條葉綠體基因組序列中共存在10個SNPs和60個InDels，其中基因間隔區有4個SNPs和43個InDels，內含子區有1個SNP和13個InDels，編碼區有5個SNPs和4個InDels （表3）。在10個SNPs中有3個發生了非同義替換，導致密碼子改變，分別是在rpoC1基因中堿基A替換為堿基C，使編碼的氨基酸由異亮氨酸轉變為絲氨酸；在rpoB基因中堿基C替換為堿基T，使編碼的甘氨酸轉變為精氨酸；在ycf4基因中堿基G替換為堿基C，使編碼的蛋氨酸轉變為異亮氨酸。此外，還有2個SNPs發生同義替換，密碼子未改變，其余SNPs均位于非編碼區。對大于3 bp的InDels進行多態性分析，發現共有19個位點呈現了種內的多態性 （表4），如基因間隔區pasA-ycf3分別在P. parishii_1、3、4中發生插入，在P. parishii_2、5、6中缺失；而在accD基因的編碼區及內含子分別存在的2個InDels在個體間具有多態性。

利用DnaSP分別計算了飄帶兜蘭6個個體的葉綠體基因組基因和基因間隔區的核苷酸多樣性值 （Pi），發現編碼區的Pi值為0～0.000 61，僅有5個基因的核苷酸多樣性值大于0，其中ycf4基因的Pi值最高；基因間隔區的Pi值為0～0.006 32，僅有3個基因間隔區的核苷酸多樣性值大于0，其中rps3-rpl22的Pi值最高 （附圖3），表明飄帶兜蘭種內表現了較低水平的核苷酸多樣性，基因間隔區的核苷酸多樣性相對較高。此外，還發現變異程度較高的位點主要位于LSC區，而IR區和SSC區相對保守。

2.6 飄帶兜蘭的系統發育關系

通過PhyloSuite計算出最佳堿基替換模型為TVM+F+R2，采用此模型構建系統發育樹（圖5）。16種兜蘭屬植物構成了支持率很高 （支持率均為100%） 的3個分支，其中德氏兜蘭 （P. delenatii）、杏黃兜蘭 （P. armeniacum）、白花兜蘭 （P. emersonii）和硬葉兜蘭 （P. micranthum） 構成了基部分支，歸屬于小萼亞屬 （Subgenus Parvisepalum）；文山兜蘭 （P. wenshanense）、同色兜蘭 （P. concolor） 和巨瓣兜蘭 （P. bellatulum） 形成一個單系分支，歸屬于寬瓣亞屬 （Subgenus Brachypetalum），本研究中的飄帶兜蘭6個個體未分開，形成1個分支，與長瓣兜蘭形成姐妹群。

3 討論與結論

本研究利用二代高通量測序技術對飄帶兜蘭野生居群不同個體進行淺層基因組測序，通過組裝和注釋得到飄帶兜蘭葉綠體全基因組。6個個體的葉綠體基因組的基因數量和順序一致，沒有發生基因組的重排或倒位事件。6個葉綠體基因組均為葉綠體基因組的典型四分體式結構，由IR區、LSC區、SSC區組成 （Jansen et al.， 2005）。飄帶兜蘭葉綠體基因組長度為154 403～154 809 bp，符合此前報道的蘭科及兜蘭屬植物的葉綠體基因組大小 （Kim et al.， 2014; Guo et al.， 2021）。飄帶兜蘭不同個體間的葉綠體基因組長度變化主要在LSC區，為86 581～86 983 bp；而SSC區和IR區基本保持一致，分別為2 436～2 446 bp和32 690～32 693 bp。IR區較其他被子植物有顯著的擴張，SSC區則有較大程度的收縮，僅包含rpl32和ccsA 2個基因，這些特點符合兜蘭屬葉綠體基因組特征 （Guo et al.， 2021）。與其他已報道的蘭科屬種的葉綠體全基因組的SSC區長度相比，如凌氏石豆蘭 （Bulbophyllum lingii， 18 244 bp）、王氏石斛 （Dendrobium wangliangii， 18 373 bp）、扇脈杓蘭 （Cypripedium japonicum， 21 911 bp） （Kim et al.， 2020; Shao et al.， 2020; Tang et al.， 2021），兜蘭屬的SSC區收縮嚴重，導致整個基因組的長度遠低于蘭科植物其他物種。大量SSC區的基因轉移至IR區，使得SSC區的收縮在兜蘭屬極為常見，杏黃兜蘭中甚至一些典型的SSC區基因，如ycf1、psaC、ndhD轉移至IR區 （Kim et al.， 2015; Lin et al.， 2015; Niu et al.， 2017）。有研究認為，由于IR區的基因可以利用同源重組機制修復DNA損傷，較大的IR區域更有利于質體基因組的穩定性， 因此基因的轉移可能更利于該基因的表達 （Palmer & Thompson， 1982; Wicke et al.， 2011）。這種基因轉移使得兜蘭屬SSC區具有極高多樣性，序列長度差異大，長度為524～5 913 bp，基因數目顯著不同，其種間多樣性和種內的穩定性使其具有開發成用于物種鑒定的分子標記的潛力 （Guo et al.， 2021）。

飄帶兜蘭的葉綠體基因組共編碼129個基因，包括78個蛋白質編碼基因、39個tRNA基因、8個rRNA基因，以及4個假基因，與Guo等（2021）報道的相同。4個假基因都是因大量基因片段缺失而造成功能喪失，其中ndhJ因片段缺失而導致基因缺少起始密碼子，而ndhD和ycf15的堿基缺失在50%以上。飄帶兜蘭葉綠體基因組中存在大量的ndh基因丟失，只保留了ndhB、ndhD和ndhJ，其中ndhD和ndhJ為假基因，這是SSC區收縮的原因之一。蘭科植物普遍存在ndh基因的丟失現象 （Yang et al.， 2013; Feng et al.， 2016; Niu et al.， 2017; Zavala-Páez et al.， 2020），但ndh基因的丟失程度不同，如石豆蘭屬葉綠體基因組中存在12個ndh基因 （Tang et al.， 2021），蘭屬植物葉綠體基因組中存在10個ndh基因 （胡國家， 2020），石斛屬的ndh基因丟失現象極為嚴重 （牛志韜， 2017）。葉綠體ndh基因與核基因組部分基因共同編碼NAD （P） H脫氫酶復合體，參與環式電子傳遞鏈 （CET） 途徑，在植物抗逆脅迫中起重要作用。除了蘭科植物外，在裸子植物松杉類和麻黃類中也發現ndh基因的丟失 （Braukmann et al.， 2009; Wu et al.， 2009）。Lin等（2017）研究認為，ndh基因的缺失可能是植物由自養轉為異養的進化過程。

本研究在飄帶兜蘭6個個體的基因組中共鑒定到103～107個SSR位點，其中數量最多的是單核苷酸重復序列，其次是二核苷酸重復序列，多以A、T堿基為基本重復單元，顯示了高度的A/T偏好，與Qin等（2015）、陳模舜和楊仲毅（2022）在被子植物葉綠體基因組中觀察到的情況一致。重復序列在植物基因組中扮演重要角色，因多態性較高而在群體遺傳和進化研究中經常被用來做分子標記 （Muraguri et al.， 2020）。本研究共篩選到21個SSR位點具有多態性，這些位點可開發為分子標記用于評估飄帶兜蘭種群的遺傳多樣性。此外，本研究發現非編碼區的SSR數量遠多于編碼區，說明非編碼區比編碼區具有更高遺傳多樣性，這可能由于非編碼區面臨著更大的選擇壓力 （Shaw et al.， 2007）。正向重復、反向重復、互補重復和回文重復在6個個體的葉綠體基因中都表現了多樣性。同種植物長序列重復的不同可能因序列的插入缺失而導致重復序列的類型發生改變，可能與基因重組有關 （Somaratne et al.， 2019）。

插入缺失和突變引起基因結構的差異是遺傳變異的重要來源， 代表生物個體適應環境變化的能力（Han & Xue， 2003）。種間或種內的葉綠體基因結構差異可用于近緣種間和種內的系統發育關系及群體遺傳學研究 （McCauley， 1995; Kersten et al.， 2016）。本研究在飄帶兜蘭的6個個體的葉綠體基因組中鑒定到60個InDels和10個SNPs，主要分布在基因間隔區。與其他種內葉綠體基因組比較分析相比，飄帶兜蘭的InDels和SNPs數量并不多。Muraguri等 （2020） 在蓖麻 （Ricinus communis） 12個個體的葉綠體基因組中共鑒定到162個SNPs和92個InDels；Zhang等 （2020b） 在麻櫟 （Quercus acutissima） 3個個體中共檢測到77個SNPs和255個InDels。Alexander等 （2014） 在紅槲櫟 （Quercus rubra） 4個個體中鑒定到8個SNPs和45個InDels。本研究共發現19個位點呈現種內多態性，通過mVISTA基因組比對和核苷酸多樣性 （Pi） 值的計算，發現非編碼區的核苷酸多樣性遠高于編碼區，其中rps3-rpl22的Pi值最高 （0.006 32）。在飄帶兜蘭葉綠體基因組中存在的這些基因組的結構變異可廣泛用于種間和種內關系以及遺傳多樣性研究。

遺傳多樣性是評估物種對棲息地環境適應能力以及抗逆能力的重要指標，研究遺傳多樣性和遺傳結構是制定物種保護措施的前提 （張亞紅等， 2019）。通過葉綠體全基因組的比較分析，本研究篩選出了一些多態性葉綠體基因組分子標記，為評估飄帶兜蘭的遺傳多樣性，探討系統發生、進化以及保護遺傳學研究提供遺傳學基礎。

致謝 ?中國科學院西雙版納熱帶植物園Sven Landrein、楊國平協助野外調查，云南野蘭堂生物有限公司張澤提供照片，謹致謝意。

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（ 責任編輯 蔣巧媛 ）

收稿日期： ??2023-01-25

基金項目： ??國家自然科學基金 （31870183， 32270225）。

第一作者： ?高鑫禎 （1997-），碩士，研究方向為保護生物學，（E-mail）gaoxinzhen@xtbg.ac.cn。

通信作者： ??羅艷，博士，研究員，研究方向為蘭科植物多樣性與保護，（E-mail）luoyan@xtbg.org.cn。