協日嘎-4 味散成分組成分析及6 種成分含量測定

李 君，王躍武，張 謙，翠 平，葉日貴，吉日木巴圖*

（1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110； 2.內蒙古醫科大學新藥篩選工程研究中心，內蒙古 呼和浩特 010110； 3.內蒙古醫科大學民族醫藥創新中心，內蒙古 呼和浩特 010110）

協日嘎-4 味散收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》 （蒙藥分冊），由姜黃、蒺藜、黃柏、梔子4 味中藥組成，具有殺黏、清熱、利尿之功，臨床用于治療小便閉止、尿頻尿急、尿中帶血、膀胱刺痛等［1］，而且對糖尿病誘發的腎病綜合征、皮膚潰瘍也有較好療效［2-3］。近年來，有關協日嘎-4 味散的研究大多集中于藥效評價、作用機制等方面，鮮有涉及化學組成、質量控制。

傳統中藥復方所含化學成分是其發揮功效的基礎，對其全面解析有利于藥效物質闡明，同時其含量高低與療效好壞緊密關聯，故對其開展快速、精準的多成分含量測定具有較好的現實意義。以往已有學者以單一成分或某味藥材中幾種成分為指標，對協日嘎-4 味散進行質量評價［4-6］，但尚無基于液質聯用技術的多味藥材中多成分定量分析的報道。因此，本實驗采用高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（HPLC-Q-Exactive-MS） 法分析協日嘎-4 味散成分組成，并在此基礎上采用高效液相色譜-三重四級桿質譜（HPLC-MS/MS） 法同時測定黃柏堿、綠原酸、梔子苷、小檗堿、蘆丁、姜黃素的含量，以期為該方質量評價體系建立及藥效物質闡明提供數據支撐。

1 材料

1.1 儀器 AP135W 型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）； HPLC-Q-Exactive 型高效液相色譜-質譜聯用系統儀［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］； BSA224S 型電子天平［萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； LC-MS 8045型三重四極桿液質聯用儀（日本島津公司）； DS-7510DTH 型數控超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 阿魏酸（批號PS012244，純度≥99.0%）、芹菜素 （批號PS011063，純度≥98.0%）、木犀草素 （批號PS010346，純度≥99.0%） 對照品均購自成都普思生物科技有限公司； 枸櫞酸 （ 批號 100396-202104，純度≥99.7%）、梔子苷 （批號110749-201919，純度≥99.0%）、原兒茶酸（批號110809-202207，純度≥99.0%）、綠原酸 （批號110753-202119，純度≥98.5%）、槲皮素 （批號100081-201610，純度≥99.1%）、蘆丁 （批號100080-202012，純度≥98.5%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；黃柏堿（批號DSTDY002031，純度98.0%）、小檗堿（批號DSTDY002801，純度≥98.0%）、異鼠李素（批號DSTDY006301，純度≥98.0%） 對照品均購自成都德思特生物技術有限公司。

姜黃 （ 批號 20111404 ）、黃柏 （ 批號20111803）、梔子（批號21072703）、蒺藜（批號20110802） 飲片均購自安國市久旺藥業有限公司，經內蒙古醫科大學藥學院渠弼教授鑒定為正品。協日嘎-4 味散 （自制，批號20230218、20230304、20230308、20230310、20230311）。

甲醇、乙腈均為色譜純； 甲酸、乙酸銨均為分析純； 水為蒸餾水［屈臣氏集團（香港） 有限公司］。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 定性分析對照品溶液 分別精密稱取對照品黃柏堿5.50 mg、綠原酸5.03 mg、梔子苷2.47 mg、小檗堿4.30 mg、蘆丁4.01 mg、姜黃素6.26 mg、阿魏酸2.66 mg、木犀草素3.18 mg、槲皮素4.07 mg、原兒茶酸3.89 mg、芹菜素3.85 mg、異鼠李素4.11 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇超聲定容，制成質量濃度分別為550.00、503.00、247.00、430.00、401.00、626.00、266.00、318.00、407.00、389.00、385.00、411.00 μg/mL的貯備液，分別精密量取100 μL，置于同一10 mL量瓶中，即得 （各成分質量濃度分別為5.50、5.03、2.47、4.30、4.01、6.26、2.66、3.18、4.07、3.89、3.85、4.11 μg/mL），在 4 ℃下保存。

2.1.2 定量分析對照品溶液 精密稱取對照品梔子苷2.47 mg、姜黃素2.28 mg，置于同一10 mL量瓶中，精密量取“2.1.1” 項下黃柏堿、綠原酸、小檗堿、蘆丁貯備液適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，即得 （黃柏堿、綠原酸、梔子苷、小檗堿、蘆丁、姜黃素質量濃度分別為22.00、65.59、247.00、150.50、2.81、228.00 μg/mL），在4 ℃下保存。

2.1.3 供試品溶液 取本品（批號20230218） 約0.5 g，精密稱定，置于50 mL 錐形瓶中，加10 mL甲醇，稱定質量，封口，超聲（功率200 W，頻率60 kHz） 提取30 min，冷卻至室溫，甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得定性分析供試品溶液； 精密量取提取液10 μL，甲醇定容至1 mL，精密量取300 μL，甲醇定容至1 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得定量分析供試品溶液。

2.1.4 空白、陰性樣品溶液 不加入本品，按“2.1.3” 項下方法制備空白溶液。分別取缺梔子、缺黃柏、缺姜黃、缺蒺藜的陰性樣品適量，按“2.1.3” 項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 HPLC-Q-Exactive-MS 定性分析

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-Aq 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流動相甲醇（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～5.0 min，5% A；5.0～8.0 min，5% ～23%A； 8.0～12.0 min，23% ～42%A； 12.0～18.0 min，42% ～58%A； 18.0～23.0 min，58% ～83%A； 23.0～30.0 min，83% ～95%A；30.0 ～40 min，95% A）； 體積流量0.35 mL/min；柱溫35 ℃； 進樣量5 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負離子模式掃描； 檢測方式Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500； 掃描范圍m/z110～1 200； 噴霧電壓3.80 kV （＋）、3.20 kV（-）； 碰撞能量30 eV； 離子傳輸管溫度300 ℃（＋）、400 ℃ （-）； 輔助氣體積流量30 L/min，溫度350 ℃。

2.2.3 數據庫建立 采用PubMed、中國知網、萬方等數據庫對全方及各味藥材所含成分的名稱、分子式、多級質譜碎片進行收集整理，Thermo Scientific Xcalibur 3.0 軟件對對照品、供試品溶液在正負離子模式下的總離子流數據進行處理，與本地數據庫比對，以一級質譜偏差在8.0×10-6以內為原則，初步對各成分進行辨識分析，再通過元素組成、多級質譜碎片信息、部分對照品比對作進一步確認。

2.2.4 成分鑒定 取“2.1.3” 項下定性分析供試品溶液適量，在“2.2.1” “2.2.2” 項條件下進樣測定，總離子流圖見圖1，結果見表1。由此可知，共鑒定出65 種成分，包括19 種生物堿、13種有機酸、13 種黃酮、7 種姜黃素、6 種環烯醚萜、4 種脂肪酸、2 種醛、1 種氨基酸，其中12 種與對照品比對得到進一步確證。

表1 協日嘎-4 味散中化學成分Tab.1 Chemical constituents in Xieriga-4 Powder

圖1 協日嘎-4 味散總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of Xieriga-4 Powder

2.2.5 黃酮類化合物解析 共有13 個，以化合物16 為例。準分子離子峰［M-H］-m/z289.071 6，可產生碎片離子m/z271.059 7 ［M-H-H2O］-、245.081 5 ［M-H-CO2］-，以及逆狄爾斯-阿德爾反應（RDA） 反應產生的m/z151.038 9 ［M-HC7H6O3］-、137.023 2 ［M-H-C8H8O3］-，基于上述裂解規律結合文獻［15］ 報道，確認為兒茶素。

2.2.6 環烯醚萜類化合物解析 共有6 個，以化合物14 為例。準分子離子峰 ［M ＋Na］＋m/z415.124 2，脫去葡萄糖基團后產生碎片離子m/z253.069 9 ［M＋Na-Glc］＋，進一步丟失H2O 和CO2，產生碎片離子m/z235.059 4 ［M＋Na-Glc-H2O］＋、217.049 1 ［M＋Na-Glc-2H2O］＋、191.069 7 ［M＋Na-Glc-H2O-CO2］＋，基于上述裂解規律結合文獻［11-13］ 報道，確認為山梔子苷。

2.2.7 有機酸類化合物解析 共有13 個，以化合物28 為例。準分子離子峰［M-H］-m/z173.044 5，連續脫去H2O、CO2、CO，產生碎片離子m/z155.033 5 ［M-H-H2O］-、137.023 5 ［M-H-2H2O］-、111.043 8 ［M-H-H2O-CO2］-、93.033 1［M-H-2H2O-CO2］-，基于上述裂解規律結合文獻［14］ 報道，確認為莽草酸。

2.2.8 生物堿類化合物解析 共有19 個，以化合物23 為例。準分子離子峰［M］＋m/z342.172 4，可產生碎片離子m/z192.103 5 ［M-C9H10O2］＋，以及發生RDA 反應產生碎片離子m/z192.103 5、177.079 8 ［M-C9H10O2-CH3］＋，基于上述裂解規律、文獻［16-17］ 報道及對照品，確認為黃柏堿。

2.2.9 姜黃素類化合物解析 共有7 個，以化合物59 為例。準分子離子峰［M＋H］＋m/z369.135 9，可產生碎片離子m/z285.114 3 ［M＋H-C4H4O2］＋、217.087 1 ［M ＋H-C9H12O2］＋、177.056 1 ［M ＋HC4H4O2-C6H5O2］＋、117.034 3 ［M ＋H-C4H4O2-C6H5O2-C2O2］＋，基于上述裂解規律、文獻［19-20］ 報道及對照品，確認為姜黃素。

2.3 HPLC-MS/MS 定量分析

2.3.1 色譜條件 Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）； 流動相甲醇（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0.01～0.35 min，5% ～18%A； 0.35～3.10 min，18% ～40%A； 3.10～4.20 min，40% ～66%A； 4.20～5.30 min，66% ～90%A；5.30～7.00 min，90% ～95% A； 7.00 ～8.00 min，95%A； 8.00～8.01 min，95% ～5%A； 8.01～10.00 min，5%A）； 體積流量0.25 mL/min； 柱溫35 ℃；進樣量3 μL。

2.3.2 質譜條件 ESI 離子源； 正負離子掃描；多反應監測（MRM） 模式； 脫溶劑溫度526 ℃；霧化氣體積流量3 L/min； 加熱氣體積流量10 L/min。

2.3.3 專屬性試驗 MRM 定量模式下各成分質譜參數見表2。取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.3.1” “2.3.2” 項條件下進樣測定，結果見圖2，可知陰性無干擾，供試品溶液中各成分保留時間與對照品溶液中的一致。

表2 各成分質譜參數Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

圖2 各成分MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of various constituents

2.3.4 線性關系考察 精密量取“2.1.1” 項下貯備液適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇稀釋定容，得質量濃度分別為0.550、2.515、7.410、1.720、0.802、6.260 μg/mL 的對照品溶液，精密吸取適量，依次稀釋100、50、20、10、2.5、2倍，在“2.3.1” “2.3.2” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度試驗 取“2.3.4” 項下對照品溶液（黃柏堿、綠原酸、梔子苷、小檗堿、蘆丁、姜黃素質量濃度分別為 55.00、251.50、741.00、172.00、80.20、626.00 ng/mL ） 適 量，在“2.3.1” “2.3.2” 項條件下進樣測定6 次，測得黃柏堿峰面積RSD 為1.14%，綠原酸峰面積RSD為1.46%，梔子苷峰面積RSD 為2.50%，小檗堿峰面積 RSD 為1.65%，蘆丁峰面積 RSD 為2.72%，姜黃素峰面積RSD 為2.34%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 取本品（批號20230218） 約0.5 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備定量分析供試品溶液，室溫下于0、4、8、12、18、24 h在“2.3.1” “2.3.2” 項條件下進樣測定，測得黃柏堿峰面積RSD 為1.09%，綠原酸峰面積RSD 為2.68%，梔子苷峰面積RSD 為2.60%，小檗堿峰面積RSD 為1.14%，蘆丁峰面積RSD 為2.70%，姜黃素峰面積RSD 為2.33%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.7 重復性試驗 取本品（批號20230218） 約0.5 g，精密稱定，平行6 份，按“2.1.3” 項下方法制備定量分析供試品溶液，在 “2.3.1”“2.3.2” 項條件下進樣測定，測得黃柏堿含量RSD 為1.68%，綠原酸含量RSD 為2.04%，梔子苷含量 RSD 為2.73%，小檗堿含量 RSD 為1.07%，蘆丁含量RSD 為2.69%，姜黃素含量RSD 為2.46%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品（批號20230218） 6 份，每份約0.25 g，精密稱定，按100% 水平加入“2.1.2” 項下定量分析對照品溶液1 mL，按“2.1.3” 項下方法制備定量分析供試品溶液，在“2.3.1” “2.3.2” 項條件下進樣測定，計算回收率。結果，黃柏堿平均加樣回收率為97.86% （RSD＝3.09%），綠原酸平均加樣回收率為96.44% （RSD＝2.05%），梔子苷平均加樣回收率為99.72% （RSD ＝3.12%），小檗堿平均加樣回收率為102.37% （RSD ＝3.62%），蘆丁平均加樣回收率為97.46% （RSD ＝2.56%），姜黃素平均加樣回收率為100.17% （RSD＝3.74%）。

2.3.9 樣品含量測定 取5 批樣品，每批3 份，按“2.1.3” 項下方法制備定量分析供試品溶液，在“2.3.1” “2.3.2” 項條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果（n＝3）Tab.4 Results for content determination of various constituents （n＝3）

3 討論

考慮到協日嘎-4 味散所含成分可能在不同流動相體系中的質譜響應強度有所差異，課題組前期對不同流動相體系進行考察，發現以甲醇-0.1%甲酸洗脫時各成分質譜響應強度、色譜峰數量較優。另外，協日嘎-4 味散富含生物堿類成分，因其所含N 原子的電負性優于C 原子而易捕獲1 個質子［17］，使得該類成分在正離子模式下具有較好的質譜響應，同時大部分黃酮類、有機酸類成分更易失去1 個質子，從而在負離子模式下的質譜響應較好，故本實驗采用正負離子模式進行分析。

然后，對6 種成分進行離子化模式分析，發現綠原酸、蘆丁、姜黃素、梔子苷在負離子模式下質譜響應較好，而黃柏堿、小檗堿在正離子模式下響應強度較高，經離子掃描、電壓優化獲得表2 質譜參數。同時，課題組前期對樣品處理方式（超聲、加熱回流）、處理時間（15、30、45 min） 進行考察，最終確定為超聲處理30 min。

4 結論

本實驗采用HPLC-Q-Exactive-MS 法在協日嘎-4 味散中鑒定了65 種成分，包括19 種生物堿、13種有機酸、13 種黃酮、7 種姜黃素、6 種環烯醚萜、4 種脂肪酸、2 種醛、1 種氨基酸，再采用HPLC-MS/MS 法測定黃柏堿、綠原酸、梔子苷、小檗堿、蘆丁、姜黃素的含量，上述方法快速簡便，可為該方藥效物質、質量標準研究提供依據，也能為其血清移行成分解析、藥動學評價指明方向。