十全大補(bǔ)湯通過調(diào)節(jié)突觸功能對阿爾茲海默病小鼠認(rèn)知損傷的改善作用

郭自賀，王 祎，朱夢姚，袁海陽，呂 馨，貢岳松，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046； 2.江蘇鵬鷂藥業(yè)新藥創(chuàng)新中心，江蘇 宜興 214200）

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD） 是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征有β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ） 沉積形成斑塊，Tau 蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失，以及神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、突觸和神經(jīng)元缺陷，最終導(dǎo)致腦萎縮和認(rèn)知障礙［1］。AD 早期的神經(jīng)變性特征為突觸功能障礙，尤其在海馬區(qū)［2］，突觸是大腦中信息傳遞和存儲(chǔ)的基本單位，其可塑性和記憶的形成受PSD-95、Shank3、NMDAR 等標(biāo)志物的調(diào)控。AMPK 是調(diào)節(jié)能量代謝穩(wěn)態(tài)的重要激酶，激活后能抑制炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化應(yīng)激，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有關(guān)鍵作用。衰老及環(huán)境中過量的金屬接觸是散發(fā)性AD 的重要致病因素，鋁是生物圈中豐度最高的神經(jīng)毒性金屬，低濃度下即顯示出較強(qiáng)的作用。D-半乳糖處理小鼠可模擬衰老過程［3］，而鋁能促進(jìn)Aβ 過表達(dá)，增強(qiáng)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，擾亂能量代謝［4］與膽堿能傳遞［5］，從而損傷認(rèn)知。

十全大補(bǔ)湯源自《太平惠民和劑局方》，是補(bǔ)血益氣的經(jīng)典方，能促進(jìn)AD 小鼠的Aβ 清除，改善膽堿能系統(tǒng)損傷，對線蟲發(fā)揮抗衰老功效［6-8］。因此，本研究采用D-半乳糖聯(lián)合AlCl3建立AD 模型，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、相關(guān)指標(biāo)檢測來探究十全大補(bǔ)湯對AD 的作用和潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 60 只SPF 級雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK （浙） 2019-0001］，飼養(yǎng)于溫度（25±1）℃、相對濕度（50±10）%、12 h/12 h 明暗循環(huán)的受控環(huán)境中，自由獲得水和食物。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號202207A069）。

1.2 試劑與藥物 十全大補(bǔ)湯各組方藥材均由南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為正品。氯化鋁 （批號A104930，美國Sigma 公司）； 鹽酸美金剛［批號E080294，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海） 有限公司］； 二甲苯（批號10023428，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 中性樹膠（批號N861409，上海麥克林生化科技股份有限公司）； 蛋白定量BCA 試劑盒（批號P0009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； SOD、MDA、ACh、AChE 試劑盒 （ 批號 A001-3-2、A003-1-2、A105-1-1、A024-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司）； TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒（批號RX202412M、RX203063M，泉州市睿信生物科技有限公司）； PSD-95、NR1、NR2A、AMPK 抗體（批號36233S、5704S、4205S、5831s，美國Cell Signaling Technology 公司）； p-AMPK 抗體（批號ab133448，英國Abcam 公司）； Shank3 抗體（批號sc-377470，美國Santa Cruz 公司）； NR2B 抗體（批號21920-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）； GAPDH 抗體（批號FD0063，杭州弗德生物科技有限公司）；D-半乳糖、二抗HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG （批號BS971、BL001A、BL003A，合肥白鯊生物科技有限公司）； ECL 發(fā)光液（批號180-5001，上海天能科技有限公司）。

1.3 儀器 Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)V2.0 （安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）； ACT-100A 型FreezeFrame 系統(tǒng)（美國Actimetrics 公司）； Tecan Infinite 200 Pro 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）； VE-180B 型垂直水浴槽、EPS300 型電泳儀、Tanon 5200 Multi 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 十全大補(bǔ)湯制備 十全大補(bǔ)湯按《太平惠民和劑局方》 中原方配比制備，10 味藥材各等分，洗凈后加水浸泡30 min，按常規(guī)方法煎煮2 次，合并濾液并濃縮至生藥量為0.624 g/mL，在-20 ℃下保存。濃縮藥液于臨用前稀釋至所需質(zhì)量濃度，0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.2 分組、造模與給藥 60 只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、美金剛組（5 mg/kg） 和十全大補(bǔ)湯高、中、低劑量組（6.24、3.12、1.56 g/kg，分別為臨床等效劑量的8、4、2 倍），每組10 只。除對照組外，其余各組小鼠腹腔注射120 mg/kgD-半乳糖并灌胃20 mg/kg AlCl3，連續(xù)70 d。第29 天開始給藥與造模間隔6 h，各給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥物，對照組和模型組灌胃等量純水，每天1 次，連續(xù)42 d。

2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d，前4 d 為訓(xùn)練期，將小鼠從各象限面向池壁放入水中，記錄60 s 內(nèi)找到平臺(tái)所需時(shí)間即為逃避潛伏期，若60 s內(nèi)小鼠未能找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記為60 s，并且需引導(dǎo)其在平臺(tái)上停留10 s，每天訓(xùn)練4 次。訓(xùn)練結(jié)束后，于第5 天進(jìn)行測試，將小鼠從任一象限放入水中，記錄其逃避潛伏期，通過Morris 水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集與記錄。

2.4 條件恐懼實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 d。第1 天為訓(xùn)練測試，將小鼠放入訓(xùn)練室中自由探索3 min，隨后暴露于2.5 Hz、85 db 的音調(diào)中30 s 作為條件刺激（CS），后給予75 mA 的雜亂足刺激2 s 作為非條件刺激（US），在一次CS/US 剝離后2 min 內(nèi)記錄小鼠僵直時(shí)間，即為瞬時(shí)僵直反應(yīng)，重復(fù)7 次，共1 244 s。24 h 后進(jìn)行保持測試，將小鼠放入同一訓(xùn)練室中20 min，不給予任何刺激，記錄其情景僵直反應(yīng)。第3 天為條件提示測試階段，改變訓(xùn)練室內(nèi)部環(huán)境，小鼠適應(yīng)3 min 后給予2.5 Hz、85 db 的音調(diào)刺激30 s，2 min后進(jìn)行下一輪音調(diào)刺激（其間無電刺激），重復(fù)10次，共1 680 s，記錄小鼠條件提示僵直反應(yīng)。采用軟件對小鼠僵直行為進(jìn)行評分，換算為僵直反應(yīng)比，公式為僵直反應(yīng)比＝ （總僵直時(shí)間/總測試時(shí)間） ×100%。

2.5 組織病理學(xué)檢查 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠麻醉脫頸處死，收集血清和腦組織。取全腦組織，在4%多聚甲醛中固定24 h 后用石蠟包埋，制備4 μm 切片，脫蠟，用蘇木素-伊紅（HE） 染色，脫水封片，在顯微鏡下觀察海馬組織CA1、CA3 區(qū)病理變化，采集圖像。

2.6 氧化應(yīng)激、炎癥水平及膽堿能系統(tǒng)功能檢測 取小鼠全腦組織置于冰上，迅速分離出海馬體，加入9 倍量生理鹽水，超聲破碎勻漿，4 ℃、4 000 r/min 離心15 min，取上清液待測。使用試劑盒檢測小鼠血清SOD 活性和MDA 水平，海馬組織SOD、AChE 活性，MDA、ACh、TNF-α、IL-1β水平。

2.7 Western blot 法檢測海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)取海馬組織，加入含1 mmol/L PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液，于冰上裂解，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，即為蛋白溶液，BCA 法測定蛋白濃度，將等量樣品與上樣緩沖液混合后煮沸5 min 進(jìn)行變性。每組上樣30 μg 蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移到NC 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBTS 清洗，將膜與HRP 標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，洗膜，ECL 發(fā)光顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，通過Image J 軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長（P＜0.01），找到平臺(tái)的路徑增長； 與模型組比較，十全大補(bǔ)湯中、高劑量組和美金剛組小鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。

圖1 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±s，n＝10）Fig.1 Effects of Shiquan Dabu Decoction on spatial learning and memory ability of AD mouse models （±s，n＝10）

3.2 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠聯(lián)想記憶能力的影響 各組小鼠在第1 天訓(xùn)練測試期中表現(xiàn)出相似的瞬時(shí)僵直水平，見圖2A。在第2 天保持測試和第3天條件提示測試階段，模型組小鼠情景僵直及條件提示僵直水平低于對照組（P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補(bǔ)湯高劑量組情景僵直反應(yīng)水平升高，中劑量組條件提示僵直水平升高（P＜0.05），見圖2B～2C。

圖2 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠聯(lián)想記憶的影響（±s，n＝10）Fig.2 Effects of Shiquan Dabu Decoction on associative memory in AD mouse models （±s，n＝10）

3.3 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響 如圖3 所示，對照組小鼠CA1、CA3 區(qū)細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)清晰，無明顯病理損傷； 模型組可見細(xì)胞排列松散，胞體固縮，胞漿濃染的異常形態(tài)； 十全大補(bǔ)湯各劑量組及美金剛組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變減少，排列更緊密，染色較均勻，病理損傷減輕。

圖3 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響（×400）Fig.3 Effects of Shiquan Dabu Decoction on morphology of neurons in hippocampus of AD mouse models （×400）

3.4 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清、海馬組織中SOD 活性降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補(bǔ)湯高、中劑量組和美金剛組小鼠血清及海馬組織SOD 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），十全大補(bǔ)湯高劑量組血清及海馬組織MDA 水平降低（P＜0.01），美金剛組小鼠海馬組織MDA 水平降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響（±s，n＝5）Fig.4 Effects of Shiquan Dabu Decoction on oxidative stress in AD mouse models （±s，n＝5）

3.5 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬組織ACh 水平降低（P＜0.01），AChE 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，十全大補(bǔ)湯高劑量組和美金剛組小鼠海馬組織ACh 水平升高（P＜0.05），十全大補(bǔ)湯高、中劑量組小鼠海馬組織AChE 活性降低（P＜0.01），見圖5。

3.6 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠海馬組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補(bǔ)湯高劑量組小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β 水平降低（P＜0.05），中劑量組小鼠海馬組織TNF-α 水平降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β水平的影響（±s，n＝5）Fig.6 Effects of Shiquan Dabu Decoction on the hippocampal levels of TNF-α and IL-1β of AD mouse models （±s，n＝5）

3.7 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠海馬組織突觸蛋白及AMPK 表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組小鼠海馬組織PSD-95、Shank3、NR1、NR2A、NR2B、p-AMPK 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，十全大補(bǔ)湯高劑量組小鼠海馬組織PSD-95、Shank3、NR1、NR2A、NR2B、p-AMPK蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），中劑量組小鼠海馬組織PSD-95、NR2A、p-AMPK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），美金剛組小鼠海馬組織PSD-95、NR2A、NR2B 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖7。

圖7 十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠海馬組織突觸蛋白及AMPK 表達(dá)的影響（±s，n＝6）Fig.7 Effects of Shiquan Dabu Decoction on synaptic protein and AMPK expression in hippocampus of AD mouse models （±s，n＝6）

4 討論

AD 作為一種年齡相關(guān)疾病，衰老被認(rèn)為是其最危險(xiǎn)誘因［10］，機(jī)體會(huì)隨之發(fā)生氧化應(yīng)激，炎性因子分泌增多，代謝功能改變等變化，因此本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠發(fā)生亞急性衰老，聯(lián)合具有神經(jīng)毒性的AlCl3，從多方面模擬AD 的病理特征。在中醫(yī)理論中AD 屬“癡呆” 范疇，因氣血兩虛、痰瘀痹阻而導(dǎo)致元神受阻，神機(jī)失用［11］。中藥復(fù)方相較于單一成分藥物具有多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢，十全大補(bǔ)湯方中人參、黃芪益氣，熟地、當(dāng)歸補(bǔ)血，白術(shù)、茯苓健脾，白芍養(yǎng)血，川芎行氣開郁，肉桂回陽通脈，甘草溫補(bǔ)脾胃［12］，有望兼治AD 本標(biāo)。

本研究首先通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測試十全大補(bǔ)湯對AD 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶和聯(lián)想記憶能力的影響［13］，結(jié)果顯示十全大補(bǔ)湯縮短了小鼠的逃避潛伏期，增強(qiáng)了情景和條件提示僵直反應(yīng)，可有效改善其認(rèn)知缺陷。海馬體是大腦中與學(xué)習(xí)記憶聯(lián)系最為緊密的組織，是情景及空間記憶形成和鞏固的必要區(qū)域［14］，HE 染色結(jié)果顯示十全大補(bǔ)湯可減輕海馬神經(jīng)元損傷，從而恢復(fù)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

在大腦衰老的過程中，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起氧化應(yīng)激［15］，破壞膽堿能系統(tǒng)功能與完整性，使AChE 活性升高，過量ACh 被水解，進(jìn)而損傷認(rèn)知功能［16］； 同時(shí)，衰老細(xì)胞會(huì)上調(diào)促炎因子如TNF-α、IL-1β 的釋放，誘發(fā)神經(jīng)炎癥。本研究顯示，十全大補(bǔ)湯能升高小鼠體內(nèi)抗氧化酶SOD 活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 水平； 此外，十全大補(bǔ)湯處理后小鼠腦內(nèi)ACh 水平升高，AChE 活性及TNF-α、IL-1β 水平下降，表明十全大補(bǔ)湯能降低AD 小鼠氧化應(yīng)激水平，恢復(fù)膽堿能傳遞，抑制炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

突觸功能障礙和丟失是AD 的主要神經(jīng)病理特征，是導(dǎo)致AD 早期記憶受損最關(guān)鍵的相關(guān)因素。突觸可塑性在電生理學(xué)上體現(xiàn)為長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP），位于突觸后膜的谷氨酸受體NMDAR 在LTP 誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］，其主要由亞單位NR1、NR2A、NR2B 組成［14］。PSD-95 是突觸后支架蛋白，可與NMDAR 相互作用并調(diào)控其功能［18］； Shank3 是突觸后結(jié)構(gòu)蛋白，通過鳥氨酸蛋白激酶與PSD-95 相連，調(diào)節(jié)前腦區(qū)域的興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)［19］。AMPK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，協(xié)調(diào)代謝和能量需求［20］，激活A(yù)MPK 可保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，修復(fù)線粒體功能障礙［21］，進(jìn)而抑制炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善突觸缺陷。本研究顯示，十全大補(bǔ)湯可增加PSD-95、Shank3、NR1、NR2A、NR2B 及p-AMPK 的表達(dá)，表明十全大補(bǔ)湯能激活A(yù)MPK 信號通路，逆轉(zhuǎn)AD 小鼠的突觸丟失，增強(qiáng)突觸可塑性。

綜上所述，十全大補(bǔ)湯能上調(diào)AMPK 信號通路，改善突觸功能障礙，抑制神經(jīng)炎癥與氧化應(yīng)激，從而恢復(fù)D-半乳糖聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)的AD 小鼠膽堿能傳遞，減輕海馬神經(jīng)元損傷，改善認(rèn)知障礙與記憶衰退。