滋水清肝飲對(duì)慢性束縛應(yīng)激抑郁小鼠海馬ERK、GSK3β、CREB、BDNF 蛋白表達(dá)的影響

曹珊珊，袁詩(shī)宇，史磊磊，張瑞華，張雨涵，石 勇，王 欣，韓朝軍*，劉繼平

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712046）

重度抑郁癥又稱為抑郁障礙，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其主要特征是持續(xù)的情緒或心境低落，常伴食欲不振、身體不適等各種軀體癥狀以及生理功能障礙等，屬于精神類疾病，本病具有患病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、疾病負(fù)擔(dān)高的特點(diǎn)［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，重度抑郁癥已成為世界第四大疾病，目前其臨床治愈率僅為27%［2］，已成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)與社會(huì)難題。

滋水清肝飲方源自 《醫(yī)宗己任編·四明心法》［3］，云“疏肝益腎湯，凡胃脘痛，大便秘結(jié)者，肝血虛也，此方主之，逍遙散所不能愈者，此方妙。柴胡、白芍、熟地、山藥、萸肉、丹皮、茯苓、澤瀉，加歸身、棗仁、山梔，名滋腎清肝飲”，以其滋腎養(yǎng)陰、清瀉肝火功效用于臨床治療抑郁、失眠等精神類疾病。研究發(fā)現(xiàn)，滋水清肝飲能有效降低抑郁患者漢密爾頓抑郁量表評(píng)分，抑制血清孤啡肽水平，進(jìn)而提高機(jī)體內(nèi)5-羥色胺（5-HT） 表達(dá)，改善抑郁癥狀［4］，還能有效改善慢性腎衰竭伴發(fā)抑郁癥患者的抑郁狀況［5］。因此，本研究采用慢性束縛應(yīng)激 （chronic restraint stress，CRS） 建立小鼠重度抑郁癥模型，進(jìn)一步研究滋水清肝飲防治抑郁癥的作用和可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)C57BL 雄性小鼠，6 ～8周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川）2020-030］，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，墊料和飼料均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)SUCMDL20210310006）。

1.2 藥物 滋水清肝飲組方藥材（熟地黃10 g、山茱萸10 g、山藥10 g、當(dāng)歸10 g、白芍10 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g、梔子10 g、酸棗仁10 g、柴胡6 g） 均購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室顏永剛教授鑒定為正品，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 一部相關(guān)規(guī)定，飲片加10 倍量水浸泡40 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火慢煎1 h，趁熱過(guò)濾，濾渣加8 倍量水，武火煮沸，文火慢煎40 min，合并濾液，常壓80 ℃濃縮，即得高劑量滋水清肝飲（1.7 g/mL），稀釋2 倍為中劑量，稀釋4 倍為低劑量。滋水清肝飲總方106 g，按人與小鼠體表面積換算，等效劑量為17.670 g/kg，即中劑量，同時(shí)設(shè)定低、高劑量分別為8.835、35.340 g/kg。鹽酸氟西汀（批號(hào)33323） 購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress 公司，每1 mg溶于2 mL 純水中，給藥劑量為10 mg/kg，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 試劑與儀器 小鼠5-HT 試劑盒 （批號(hào)20221020，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）； 小鼠腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-1β （IL-1β） 試劑盒（批號(hào)202209、202209，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）； 丙二醛 （MDA）、總超氧化物歧化酶（SOD） 試劑盒（批號(hào)20220831、20221213，南京建成生物工程研究所有限公司）； ERK1/2、p-ERK、GSK-3β、p-GSK3β、GAPDH 抗體（批號(hào)00115457、00106696、00117935、00106696、10017731，美國(guó)Proteintech 公司）； CREB 抗體（批號(hào)4000000113，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）； 羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、BDNF 抗體、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)BA1050、BA1051、GB11559、AR1197，武漢博士德生物工程有限公司）； RNAiso Plus、Oligo dT （50 μmol/L）、5 × M-MLV Buffer、dNTP （10 mmol/L）、RTase M-MLV （200 U/mL）、RTase inhibitor （40 U/mL）、TB Green Premix Ex Taq、50× ROX Reference Dye Ⅱ （ 批號(hào) AL11814A、AL11594A、2641Q、AKE1955A、AK71336A、AKF1047A、AK90852A、SDO384，日本TaKaRa 公司）。酶標(biāo)儀、多功能酶標(biāo)儀 （美國(guó)BioTek 公司）； 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）； PCR 儀（杭州博日科技股份有限公司）； 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，空白組不作處理，造模組采用自制打孔離心管進(jìn)行21 d 慢性束縛應(yīng)激處理，即每天將小鼠禁錮于安靜昏暗的環(huán)境6 h［6-7］。造模結(jié)束后，進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)，以糖水偏好率小于75% 為造模成功標(biāo)準(zhǔn)［8］。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、鹽酸氟西汀組（10 mg/kg） 和滋水清肝飲低、中、高劑量組（8.835、17.670、35.340 g/kg），每組10只，模型組和空白組灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應(yīng)劑量藥液，容積0.4 mL/20 g，給藥結(jié)束30 min 后除空白組外，其余小鼠繼續(xù)進(jìn)行CRS 處理。

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 小鼠暴露于2 個(gè)完全相同的水瓶中，分別裝有1%蔗糖水和飲用水，以排除小鼠對(duì)個(gè)別水瓶的偏好。第1 天適應(yīng)24 h 后互換1%糖水、飲用水的水瓶位置，以避免小鼠在飲水期間形成特殊的位置偏好； 第2 天繼續(xù)適應(yīng)24 h；第3 天所有小鼠禁水禁食24 h，結(jié)束后進(jìn)行2 h 的糖水偏好檢測(cè)，檢測(cè)前對(duì)1%糖水和自來(lái)水瓶分別稱重，2 h 后取下2 瓶再次稱重，計(jì)算糖水偏好率，公式為糖水偏好率＝ ［糖水飲用量/（自來(lái)水飲用量＋糖水飲用量）］ ×100%。

2.2.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 將小鼠倒掛在頭部距離地面20 cm 高的裝置上，記錄6 min 內(nèi)懸尾不動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)其表現(xiàn)為被動(dòng)懸掛、沒(méi)有任何肢體活動(dòng)時(shí)可判定為不動(dòng)，秒表計(jì)算后4 min 內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間。

2.2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 將小鼠放入高24.5 cm、直徑16 cm 的高硼硅玻璃容器中，盛有20 cm 深的水，水溫保持在（23±2）℃，視頻記錄6 min 內(nèi)游泳狀態(tài)，當(dāng)其沒(méi)有明顯的游泳動(dòng)作時(shí)被認(rèn)為漂浮不動(dòng)，秒表計(jì)算后4 min 內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間。

2.3 HE 染色觀察海馬組織病理形態(tài)變化 取固定24 h 以上的全腦組織，石蠟切片4 μm，脫水，脫蠟，蘇木素染色3～5 min，自來(lái)水洗，返藍(lán)，脫水，伊紅染色5 min，脫水，透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察小鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用試劑盒檢測(cè)小鼠血清SOD 活性和MDA 水平，ELISA 試劑盒檢測(cè)血清5-HT、TNF-α、IL-1β 水平。

2.5 RT-qPCR 法檢測(cè)海馬組織BDNF、TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá) 采用氯仿提取法提取各組總RNA，核酸定量法檢測(cè)濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系（20 μL） 為TB Green Premix Ex Taq 10 μL、正反向引物 （10 μmol/L） 各0.4 μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL、DNA 模板2 μL、RNase free H2O 6.8 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃5 s，60 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)，定量PCR 特異產(chǎn)物通過(guò)熔解曲線分析，引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測(cè)海馬組織ERK1/2、GSK-3β、CREB、BDNF 蛋白表達(dá) 取小鼠一側(cè)海馬組織，加入RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，在低溫冷凍研磨儀中充分研磨，4 ℃離心取上清液，BCA 法蛋白定量后取等量蛋白上樣，通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF 膜上，TBST 清洗后在5% 脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入一抗ERK1/2 （1 ∶1 000）、p-ERK1/2 （1 ∶3 000）、GSK3β （1 ∶4 000）、p-GSK3β（1 ∶3 000）、CREB （1 ∶ 1 000）、BDNF （1 ∶5 000）、GAPDH （1 ∶25 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，利用Image J 軟件計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，若符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間比較采用LSD 法，方差不齊時(shí)組間比較采用Games-Howell 法； 若不符合正態(tài)分布，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠行為學(xué)的影響

3.1.1 糖水偏好率 與空白組比較，給藥前模型組及各給藥組糖水偏好率降低（P＜0.01）。給藥7 d后，與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲中劑量組糖水偏好率升高（P＜0.05），滋水清肝飲低、高劑量組糖水偏好率無(wú)明顯變化 （P＞0.05）。給藥14 d 后，與模型組比較，各給藥組糖水偏好率升高（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠糖水偏好率的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of Zishui Qinggan Decoction on preference rate of sugar water in CRS depressed mice （±s，n＝8）

表2 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠糖水偏好率的影響（±s，n＝8）Tab.2 Effects of Zishui Qinggan Decoction on preference rate of sugar water in CRS depressed mice （±s，n＝8）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別糖水偏好率/%給藥前給藥7 d 后給藥14 d 后空白組88.27±2.7190.08±4.5689.78±6.14模型組54.03±13.87＃＃51.06±17.77＃＃46.77±14.94＃＃鹽酸氟西汀組52.34±15.20＃＃71.87±8.85*83.22±12.16**滋水清肝飲低劑量組52.27±6.07＃＃66.22±16.8781.50±7.88**滋水清肝飲中劑量組50.06±12.82＃＃74.69±13.83*85.52±5.44**滋水清肝飲高劑量組54.11±10.90＃＃68.55±17.8779.34±7.55*

3.1.2 懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間 與空白組比較，模型組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.01）； 給藥7、14 d 后，與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲各劑量組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間縮短（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of Zishui Qinggan Decoction on immobilization time of tail suspension experiment in CRS depressed mice （±s，n＝8）

表3 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響（±s，n＝8）Tab.3 Effects of Zishui Qinggan Decoction on immobilization time of tail suspension experiment in CRS depressed mice （±s，n＝8）

注： 與空白組比較，＃＃P ＜0.01； 與模型組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01。

組別不動(dòng)時(shí)間/s給藥7 d 后給藥14 d 后空白組81.98±27.9179.55±30.94模型組142.23±19.03＃＃146.60±13.94＃＃鹽酸氟西汀組96.45±38.95*83.07±21.76**滋水清肝飲低劑量組97.85±24.61*99.71±21.11**滋水清肝飲中劑量組85.55±19.81**83.10±13.81**滋水清肝飲高劑量組92.75±20.95*106.54±35.95*

3.1.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間 與空白組比較，模型組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng) （P＜0.01）； 給藥7、14 d后，與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲各劑量組小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間縮短（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響（±s，n＝8）Tab.4 Effects of Zishui Qinggan Decoction on immobilization time of forced swimming experiment in CRS depressed mice （±s，n＝8）

表4 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響（±s，n＝8）Tab.4 Effects of Zishui Qinggan Decoction on immobilization time of forced swimming experiment in CRS depressed mice （±s，n＝8）

注： 與空白組比較，＃＃P ＜0.01； 與模型組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01。

組別不動(dòng)時(shí)間/s給藥7 d給藥14 d空白組90.80±16.3786.54±18.54模型組150.55±16.74＃＃155.43±13.51＃＃鹽酸氟西汀組83.72±17.60**87.97±14.99**滋水清肝飲低劑量組105.29±12.06*121.81±15.83*滋水清肝飲中劑量組93.08±25.66**96.67±20.84**滋水清肝飲高劑量組111.30±16.15*128.33±19.04*

3.2 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響 空白組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)飽滿，輪廓清晰； 模型組細(xì)胞變形，顏色被深染，輪廓模糊，結(jié)構(gòu)形態(tài)較差； 與模型組比較，滋水清肝飲中劑量組及鹽酸氟西汀組病理形態(tài)明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，核固縮現(xiàn)象較少； 滋水清肝飲低、高劑量組有部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，見(jiàn)圖1。

圖1 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響（HE，×400）Fig.1 Effects of Zishui Qinggan Decoction on hippocampal neuron injury in CRS depressed mice （HE，×400）

3.3 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠血清生化指標(biāo)的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清5-HT 水平和SOD 活性降低 （P＜0.01），TNF-α、IL-1β、MDA 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲中劑量組小鼠血清5-HT 水平和SOD 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α、IL-1β、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），滋水清肝飲低劑量組5-HT、MDA 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），TNF-α、IL-1β 水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.01），滋水清肝飲高劑量組5-HT水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），TNF-α、IL-1β、MDA水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠血清5-HT、TNF-α、IL-1β、MDA 水平和SOD 活性的影響（±s，n＝8）Tab.5 Effects of Zishui Qinggan Decoction on serum levels of 5-HT，TNF-α，IL-1β，MDA and SOD activity in CRS depressed mice （±s，n＝8）

表5 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠血清5-HT、TNF-α、IL-1β、MDA 水平和SOD 活性的影響（±s，n＝8）Tab.5 Effects of Zishui Qinggan Decoction on serum levels of 5-HT，TNF-α，IL-1β，MDA and SOD activity in CRS depressed mice （±s，n＝8）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別5-HT/（ng·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）IL-1β/（pg·mL-1）SOD/（U·mL-1）MDA/（nmol·mL-1）空白組190.35±7.79628.51±15.11108.57±3.31119.66±3.055.30±0.53模型組173.70±5.50＃＃739.02±27.05＃＃133.43±10.83＃＃85.10±14.06＃＃7.43±0.92＃＃鹽酸氟西汀組188.00±9.27**667.61±22.53**113.47±3.75*116.96±13.58**5.45±0.94**滋水清肝飲低劑量組179.47±11.39673.06±21.68*117.25±6.88*101.52±9.77**7.36±1.13滋水清肝飲中劑量組184.76±3.60*665.75±27.38*110.16±3.61*110.53±7.48**5.46±0.35**滋水清肝飲高劑量組177.97±10.30678.91±33.67*113.16±5.31*91.91±12.16*6.28±0.94*

3.4 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬組織BDNF、TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織BDNFmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲中、高劑量組小鼠海馬組織BDNFmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），滋水清肝飲低劑量組小鼠海馬組織BDNFmRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），TNF-α、IL-1βmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬組織BDNF、TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.6 Effects of Zishui Qinggan Decoction on hippocampal mRNA expressions of BDNF，TNF-α and IL-1β of CRS depressed mice （±s，n＝5）

表6 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬組織BDNF、TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.6 Effects of Zishui Qinggan Decoction on hippocampal mRNA expressions of BDNF，TNF-α and IL-1β of CRS depressed mice （±s，n＝5）

注： 與空白組比較，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別BDNF mRNATNF-α mRNAIL-1β mRNA空白組1.00±0.081.00±0.111.00±0.06模型組0.64±0.12＃＃3.00±0.80＃＃3.01±0.13＃＃鹽酸氟西汀組1.01±0.36**1.47±0.46**1.71±0.75**滋水清肝飲低劑量組0.64±0.072.01±0.49*2.15±0.91*滋水清肝飲中劑量組1.38±0.37**1.74±0.60**1.95±0.31**滋水清肝飲高劑量組1.09±0.26**2.14±0.43*2.33±0.98*

3.5 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬組織ERK1/2、GSK3β、CREB、BDNF 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織p-ERK1/2、p-GSK3β、CREB、BDNF 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與模型組比較，鹽酸氟西汀組及滋水清肝飲各劑量組小鼠海馬組織p-ERK1/2、p-GSK3β、CREB、BDNF 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖2、表7。

圖2 各組小鼠海馬組織ERK1/2、GSK3β、CREB、BDNF 蛋白電泳圖Fig.2 Electropherograms of ERK1/2，GSK3β，CREB and BDNF proteins in hippocampus of mice in each group

表7 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬組織ERK1/2、GSK3β、CREB、BDNF 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.7 Effects of Zishui Qinggan Decoction on hippocampal protein expressions of ERK1/2，GSK3β，CREB and BDNF of CRS depressed mice （±s，n＝3）

表7 滋水清肝飲對(duì)CRS 抑郁小鼠海馬組織ERK1/2、GSK3β、CREB、BDNF 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Tab.7 Effects of Zishui Qinggan Decoction on hippocampal protein expressions of ERK1/2，GSK3β，CREB and BDNF of CRS depressed mice （±s，n＝3）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別p-ERK1/2/ERK1/2p-GSK3β/GSK3βCREB/GAPDHBDNF/GAPDH空白組0.64±0.040.89±0.070.68±0.020.26±0.02模型組0.23±0.04＃＃0.53±0.12＃＃0.32±0.03＃＃0.16±0.01＃鹽酸氟西汀組0.82±0.09**0.68±0.10*0.63±0.01**0.50±0.02**滋水清肝飲低劑量組0.75±0.05**0.77±0.02*0.92±0.07**0.33±0.30**滋水清肝飲中劑量組0.96±0.06**0.89±0.05**0.95±0.02**0.51±0.01**滋水清肝飲高劑量組0.82±0.11**0.72±0.05*0.78±0.03**0.41±0.05**

4 討論

眾所周知，壓力是重度抑郁癥發(fā)展的致病因素之一［9］。CRS 是抑郁動(dòng)物研究中常見(jiàn)的慢性應(yīng)激模型，是一種同時(shí)誘導(dǎo)心理和生理壓力的經(jīng)典方法。本研究采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)判斷小鼠是否存在快感缺失的狀況，并根據(jù)小鼠快感缺失的情況進(jìn)行剔除和分組，在一定程度上保證后續(xù)驗(yàn)證滋水清肝飲抗抑郁效果的準(zhǔn)確性。懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間主要用來(lái)評(píng)估抑郁中的絕望行為，不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)表示小鼠對(duì)生存的意愿越低、絕望性越高。研究表明，海馬CA1 容易受到壓力的影響，導(dǎo)致神經(jīng)元的樹突分枝和脊椎密度的減少進(jìn)而影響其海馬體積及細(xì)胞形態(tài)［10］，本研究結(jié)果顯示，中劑量滋水清肝飲及鹽酸氟西汀可對(duì)CRS 抑郁小鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷起到一定的防治作用。當(dāng)給予滋水清肝飲后抑郁小鼠對(duì)糖水的偏好性增強(qiáng)，不動(dòng)時(shí)間縮短，小鼠血清5-HT 水平和SOD 活性升高，MDA及炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平降低，提示滋水清肝飲具有一定的抗抑郁作用［11］。

BDNF 作為與神經(jīng)可塑性、記憶力和情感表達(dá)相關(guān)的重要因子，是抑郁障礙發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素之一，且BDNF 水平隨著抑郁嚴(yán)重程度的增加而降低［12］。在抑郁自殺患者的大腦中發(fā)現(xiàn)BDNF 蛋白表達(dá)降低［13］，給予抑郁癥病人抗抑郁藥物治療后能夠使血液中BDNF 水平回到正常范圍［14］； 嚙齒動(dòng)物暴露于慢性應(yīng)激，早年生活應(yīng)激或不可預(yù)測(cè)應(yīng)激都會(huì)使海馬體中BDNF 表達(dá)降低［15-16］，這些研究都表明BDNF 水平升高可支持抗抑郁藥賦予其有益功能的機(jī)制［17］。CREB 作為BDNF 的正向靶點(diǎn)，已被證明是BDNF 介導(dǎo)細(xì)胞存活的關(guān)鍵介質(zhì)，兩者的表達(dá)有一定的相關(guān)性［18］。CREB 可以被各種激酶激活，包括ERK、GSK3β 等。GSK3β 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要分布在神經(jīng)元，GSK3β 活性增加支持細(xì)胞凋亡，活性減弱增強(qiáng)神經(jīng)可塑性和細(xì)胞彈性［19］，神經(jīng)元調(diào)節(jié)GSK3β 活性的主要方式是通過(guò)控制Ser9 的磷酸化，GSK3β 在Ser9 殘基處的磷酸化可以抑制GSK3β 響應(yīng)正向信號(hào)的活性［20］。研究表明GSK3β活性的調(diào)節(jié)與許多情緒穩(wěn)定劑和抗抑郁藥的直接或下游作用機(jī)制有關(guān)［21］，主要通過(guò)CREB 為中介，調(diào)節(jié)BDNF 的轉(zhuǎn)錄從而達(dá)到抗抑郁樣作用的效果。ERK 為絲裂原活化蛋白激酶的原型亞家族，在幾種ERK 亞型（ERK1/2/3/4/5/7） 中，ERK1/2 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的研究和表征最為顯著［22］。現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，ERK1/2 在包括抑郁癥在內(nèi)的各種神經(jīng)精神疾病中起著關(guān)鍵作用［23］，不僅可以激活CREB 參與神經(jīng)元存活和神經(jīng)保護(hù)，還可以促進(jìn)BDNF 對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮抗損傷和促生長(zhǎng)的作用，從而影響抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展［24］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)給予抑郁小鼠滋水清肝飲及鹽酸氟西汀后，小鼠海馬組織 BDNF、CREB、p-ERK1/2、p-GSK3β 蛋白表達(dá)升高，海馬組織BDNFmRNA 表達(dá)升高，表明滋水清肝飲可以通過(guò)ERK1/2/GSK3β/CREB/BDNF 通路參與抑郁癥發(fā)病進(jìn)展。

綜上所述，滋水清肝飲可以通過(guò)上調(diào)抑郁小鼠糖水偏好率，降低抑郁小鼠對(duì)生存的絕望性，提高5-HT 水平，降低炎癥因子水平，調(diào)控ERK1/2/GSK3β/CREB/BDNF 通路發(fā)揮抗抑郁作用，有望成為治療抑郁癥的潛在新策略。