薯蕷皂苷元對人骨肉瘤細胞自噬的影響

聶 超，黃華明，侯保權，周 杰，張 蕾*

（1.江蘇衛生健康職業學院，江蘇 南京 211800； 2.無錫市錫山人民醫院，江蘇 無錫 214015； 3.南京帝瑪生物技術有限公司，江蘇 南京 210033）

骨肉瘤是起源于骨骼的惡性腫瘤，患者大多為青少年，惡性程度高，預后差［1］，這為患者及其家庭帶來極大的精神傷害，也為社會乃至國家帶來沉重的經濟負擔。骨肉瘤的發生、發展與細胞生長有關，目前臨床化療是治療手段之一，但由于缺乏理想效果、耐藥性頻繁出現、毒副作用較強等問題［2］，在臨床上頗受爭議。因此，從天然產物中提取高效、低毒的活性成分進行替代成為當前新的趨勢。

薯蕷皂苷元是從薯蕷科植物穿龍薯蕷根中分離出的一種植物甾體化合物，也是合成甾體激素類藥物的重要原料，具有抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂、抗免疫逃逸等作用［3-6］，但關于誘導骨肉瘤的自噬未見報道，而且分子作用機制不明。本實驗旨在對薯蕷皂苷元誘導骨肉瘤產生自噬進行探討，并闡明其作用機制。

1 材料

1.1 細胞株 人骨肉瘤MG63、U2OS 細胞均購自美國ATCC 庫，分別用90% MEM＋10% FBS、90%DMEM＋10% FBS 完全培養基，在37 ℃、5% CO2條件下培養，每2 d 更新1 次培養液，取對數生長期者進行實驗。

1.2 試劑與藥物 薯蕷皂苷元（成都曼思特生物科技有限公司，貨號A0124，純度≥98%）。TRIzol（美國Invitrogen 公司，貨號15596-026）； cDNA 第一鏈合成試劑盒、Taq DNA Polymerase （美國Thermo Fisher Scientific 公 司，貨 號 K1622、EP0405）； LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR、pPI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin1、cleaved-caspase3 蛋白抗體、抗體稀釋液、GAPDH 內參抗體、Braford 蛋白含量檢測試劑盒 （江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細胞增殖 取MG63、U2OS 細胞懸液，調整密度至5.0×104/mL，接種于96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，培養24 h，分別加入含40、20、10、5、2.5、1.25 mg/L 薯蕷皂苷元的完全培養基，同時設立陰性對照組，將細胞培養板置于含37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h，按說明書進行MTT 染色，于490 nm 波長處測定光密度（OD），計算細胞增殖抑制率及藥物IC50。

2.2 透射電鏡檢測細胞自噬情況 取MG63、U2OS 細胞懸液，調整密度至5.0×105/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養基 （MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L） 共同培養24 h，0.25%胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液，1 000 r/min 離心10 min，棄上清后PBS 洗滌2 次，加入2.5%戊二酸，4 ℃固定90 min，經包埋、切片、檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾染色后觀察各組細胞自噬小體。

2.3 免疫熒光觀察Beclin1 蛋白表達 取MG63、U2OS 細胞懸液適量，調整密度至5.0×104/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養基（MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L），培養24 h 后自然晾干并用多聚甲醛固定液浸泡，加入H2O2-甲醇溶液、即用型山羊血清室溫孵育20 min，PBS 洗滌3 次，滴加一抗（1 ∶100）、二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，加入DAPI 染液后用防萃滅封片膠封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞高表達區域。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件計算視野面積下的積分光密度（IOD） 值，求得平均光密度，公式為平均光密度＝IOD/視野面積。

2.4 Western blot 法檢測細胞LC3、Beclin1、cleavedcaspase3、PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達 取MG63、U2OS 細胞懸液適量，調整密度至5.0×105/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養基（MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L），培養24 h 后采用全蛋白提取試劑盒提取細胞中的總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行濃度測定。蛋白樣本經10% SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，通過Bio-Rad 半干轉印系統進行轉膜，所得PVDF 膜用5% 脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗（1 ∶200） 孵育過夜，次日室溫孵育二抗（1 ∶4 000） 1 h，ECL 試劑顯色，凝膠成像儀和Gel-Pro32 軟件采集圖像，對條帶進行灰度分析。

2.5 RT-qPCR 法檢測細胞Beclin1、caspase3 mRNA表達 取MG63、U2OS 細胞懸液適量，調整密度至5.0×105/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養基（MG63，0、16 mg/L； U2OS，0、8 mg/L），培養24 h 后收集細胞，TRIzol 法提取總RNA，測定純度后反轉錄為cDNA，熒光染色法和熒光定量PCR儀進行實時定量PCR 反應，擴增條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸20 s，72 ℃變性35 s，共循環45 次。擴增產物特異性通過熔解曲線監測，以GAPDH為內參，2-ΔΔCT法分析基因相對表達量，所用引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 統計學分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞增殖的影響 如圖1 所示，不同質量濃度 （40、20、10、5、2.5、1.25 mg/L） 薯蕷皂苷元對骨肉瘤MG3、U2OS 細胞均有抑制作用，并呈劑量依賴性。薯蕷皂苷元對MG63 細胞作用24 h 的IC50值為15.7 mg/L，U2OS細胞的IC50值為8.3 mg/L，故后續實驗選取薯蕷皂苷元16 mg/L 作用于MG63 細胞，8 mg/L 作用于U2OS 細胞。

圖1 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞增殖的影響（±s，n＝5）Fig.1 Effects of diosgenin on the proliferation of osteosarcoma cells （±s，n＝5）

3.2 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞超微結構形態變化的影響 如圖2 所示，對照組骨肉瘤MG3、U2OS細胞可見正常細胞核和大量線粒體； 薯蕷皂苷元處理后，MG3、U2OS 細胞損傷明顯，細胞破碎，線粒體消失，出現包裹著線粒體的自噬體。

圖2 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞超微結構形態變化的影響Fig.2 Effects of diosgenin on ultrastructural changes of osteosarcoma cells

3.3 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞Beclin1 蛋白表達的影響 如圖3 所示，對照組骨肉瘤MG3、U2OS 細胞Beclin1 蛋白熒光表達較低； 與對照組比較，薯蕷皂苷元干預后MG3、U2OS 細胞Beclin1 蛋白熒光表達增強（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞Beclin1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.3 Effects of diosgenin on expression of Beclin1 protein in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.4 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞LC3、Beclin1 蛋白表達的影響 如圖4 所示，與對照組比較，薯蕷皂苷元干預后骨肉瘤MG3、U2OS 細胞LC3 Ⅰ蛋白表達降低（P＜0.01），LC3 Ⅱ、Beclin1 蛋白表達升高（P＜0.01）。

圖4 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞LC3、Beclin1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of diosgenin on protein expressions of LC3 and Beclin1 in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.5 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達的影響 如圖5 所示，與對照組比較，薯蕷皂苷元干預后骨肉瘤MG3、U2OS 細胞PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達無明顯變化 （P＞0.05），p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細胞PI3K/Akt/mTOR 通路相關蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.5 Effects of diosgenin on expressions of PI3K/Akt/mTOR pathway-related proteins in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.6 PI3K 通路抑制劑LY294002 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞Beclin1 mRNA 表達的影響 如圖6所示，與對照組比較，骨肉瘤MG3、U2OS 細胞薯蕷皂苷元組Beclin1 mRNA 表達升高（P＜0.01）；與薯蕷皂苷元組比較，薯蕷皂苷元＋LY294002 組Beclin1 mRNA 表達降低（P＜0.01）。

圖6 LY294002 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞Beclin1 mRNA 表達的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of LY294002 on expression of Beclin1 mRNA in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

3.7 自噬抑制劑3MA 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞增殖的影響 如圖7 所示，與3MA 組比較，骨肉瘤MG3、U2OS 細胞薯蕷皂苷元組增殖抑制率升高（P＜0.01）； 與薯蕷皂苷元組比較，MG3、U2OS細胞薯蕷皂苷元＋3MA 組增殖抑制率降低 （P＜0.01）。

圖7 3MA 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞增殖的影響（±s，n＝5）Fig.7 Effects of 3MA on proliferation of osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝5）

3.8 自噬抑制劑3MA 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞caspase3 mRNA、蛋白表達的影響 如圖8～9 所示，與對照組比較，骨肉瘤MG3、U2OS 細胞薯蕷皂苷元組caspase3 mRNA 表達和cleaved-caspase3 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與薯蕷皂苷元組比較，MG3、U2OS 細胞薯蕷皂苷元＋3MA 組caspase3 mRNA 表達和cleaved-caspase3 蛋白表達降低（P＜0.01）。

圖8 3MA 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞caspase3 mRNA表達的影響（±s，n＝3）Fig.8 Effects of 3MA on caspase3 mRNA expression in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

圖9 3MA 對薯蕷皂苷元干預骨肉瘤細胞caspase3 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.9 Effects of 3MA on caspase3 protein expression in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

4 討論

本研究通過MTT 實驗，計算出24 h 薯蕷皂苷元對MG63 細胞IC50為15.7 mg/L，U2OS 細胞IC50為8.3 mg/L，結果顯示薯蕷皂苷元對2 種骨肉瘤細胞均有抑制作用，呈劑量依賴性。

自噬是另一種有別于凋亡的細胞死亡方式，指在真核細胞中由雙層膜包裹部分胞質以及細胞內需降解的細胞器、蛋白質等形成自噬體［7］。通過透射電鏡實驗發現，薯蕷皂苷元干預后，2 種骨肉瘤細胞中的自噬體均開始增多，初步證明薯蕷皂苷元可以誘導2 種骨肉瘤細胞產生自噬。

Beclin1 是Atg6 的同源基因，Beclin1 表達與多種惡性腫瘤細胞發生自噬呈正相關。微管相關蛋白輕鏈3 （LC3） 是自噬體中酵母Atg8 的同源基因，LC3 被刺激后可產生胞漿LC3I，經過類泛素化修飾最終形成LC3Ⅱ［8］。LC3Ⅱ表達量與自噬泡的數量呈正相關性，LC3Ⅱ增加可啟動自噬發生［9］。本實驗結果顯示，經薯蕷皂苷元干預后，2 種骨肉瘤細胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達升高，LC3I 蛋白表達降低，證明薯蕷皂苷元能夠誘導骨肉瘤細胞產生自噬。

眾多信號通路參與自噬的調節，其中PI3K/Akt/mTOR 信號通路被認為是負性調控自噬啟動的經典通路［10］。PI3K 被激活后，激活下游蛋白Akt，活化的Akt 通過激活其下游蛋白雷帕霉素的蛋白激酶受體（mTOR），促進細胞生長［11-12］。本實驗結果顯示，薯蕷皂苷元可以抑制2 種骨肉瘤細胞PI3K、Akt、mTOR 蛋白的磷酸化水平，提示薯蕷皂苷元可以通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活骨肉瘤細胞的自噬。PI3K/Akt/mTOR 信號通路除了與自噬的生成有關，在腫瘤細胞的生長、凋亡、炎癥產生等多方面均能發揮作用［13-15］。本實驗通過薯蕷皂苷元和PI3K 通路抑制劑LY294002 聯合處理，發現在通路抑制劑的干預下，2 種骨肉瘤細胞Beclin1 mRNA 表達降低，提示PI3K/Akt/mTOR 信號通路可能是薯蕷皂苷元抑制骨肉瘤細胞產生自噬的作用靶點。

近年來研究表明，自噬具有抑制腫瘤的作用，也可保護腫瘤細胞生存［16-17］，當前多種化療藥物就是通過自身產生的保護性自噬作用產生耐藥性［18］。本實驗通過薯蕷皂苷元和自噬抑制劑3MA聯合處理，對細胞增殖抑制、凋亡蛋白caspase3 蛋白表達進行檢測，以探究抑制自噬后薯蕷皂苷元對2 種骨肉瘤細胞凋亡的影響［19-20］。結果，在3MA的干預下2 種骨肉瘤細胞增殖抑制率降低，caspase3 mRNA 表達和cleaved-caspase3 蛋白表達均降低，提示薯蕷皂苷元誘導骨肉瘤細胞產生的自噬可抑制腫瘤細胞活性。

綜上所述，薯蕷皂苷元能抑制骨肉瘤細胞的增殖，誘導細胞產生自噬，可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路以及上調LC3 Ⅱ和Beclin1 蛋白表達有關，同時其誘導的自噬可以促使骨肉瘤細胞死亡，誘導自噬性凋亡。