真菌三萜生物合成途徑關鍵后修飾酶研究進展

占慧慧，劉 媛，孟俊華，崔培梧

（湖南中醫藥大學藥學院，國家中醫藥管理局中藥藥性與藥效三級科研實驗室，菌物藥研究室，湖南 長沙 410208）

三萜化合物（triterpenoids） 是由6 個異戊二烯單元共30 個碳原子組成的一大類天然產物，廣泛存在于細菌、真菌、植物及動物中［1］，是很多藥用真菌的重要活性成分，如靈芝Ganodermalucidum［2］、茯苓Poriacocos［3］、桑黃Phellinuslinteus［4］、樺褐孔菌Inonotusobliquus［5］、蟲草Cordyceps［6］、牛樟芝Antrodiacinnamomea［7］、蘑菇Agaricus campestris［8］、猴頭菌Hericiumerinaceus［9］等； 其化學結構的多樣性也賦予三萜豐富的生物活性，因此被視為新藥開發的重要來源之一，如靈芝中的靈芝酸［10-11］、茯苓中的茯苓酸［3，12］、樺褐孔菌中的白樺脂醇［13-15］等，均被證實具有較好的抗腫瘤、抗炎、降糖及降脂活性，且部分已進入臨床研究階段。隨著真菌三萜潛在藥用價值的持續發掘，真菌三萜的生物合成及其綜合開發相關研究吸引了眾多科研工作者的關注。目前，真菌三萜類天然產物主要從其子實體中提取，但存在野生資源匱乏、人工栽培周期長、質量穩定性差、子實體中三萜含量低等問題，同時三萜化合物的結構復雜性也限制了化學合成法在大規模生產中的應用。生物合成技術快速發展，利用代謝工程、基因工程等技術超表達或調控參與三萜生物合成途徑的關鍵酶基因，從而實現三萜的高效生物合成，已成為真菌三萜資源開發領域最有前景的開發模式。現有研究表明，三萜生物合成途徑可分為3 個階段，即前體形成、骨架構建及后修飾，目前三萜生物合成途徑關鍵酶的相關研究主要集中在前2 個階段； 由于關鍵酶的多樣性、后修飾反應的復雜性等問題，后修飾階段研究進展相對較慢，但其對于三萜化合物的結構形成及多樣性必不可少［16-18］。因此，有必要對后修飾階段的關鍵酶相關研究進行系統綜述，以期為真菌三萜生物合成途徑的充分解析、重構和定向強化提供必要參考。基于此，本文就近年來國內外有關真菌三萜生物合成途徑及其關鍵后修飾酶細胞色素P450 單加氧酶和糖基轉移酶的研究進行綜述。

1 真菌三萜的生物合成途徑

所有真菌萜類天然產物均來源于常見的五碳二磷酸異戊烯基中間體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP） 及其雙鍵異構體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），這2 種中間體都是通過甲羥戊酸途徑 （mevalonate pathway，MVA pathway） 合成［19］，見圖1。

圖1 MVA 合成途徑

經MVA 途徑合成三萜類產物的過程可分為3 個階段，首先是上游前體物質IPP 和DMAPP 的形成； 其次是4 種中間體牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）、法尼基焦磷酸 （farnesyl diphosphate，FPP）、鯊烯 （squalene，SQ）、2，3-氧化鯊烯（2，3- oxidosqualene） 的合成及三萜骨架構建； 最后是下游后修飾過程（氧化還原、酰化、糖基化等）。圖1 中列舉了具有代表性的三萜骨架類型，包括四環的達瑪烷型、環阿屯烷型，五環的烏蘇烷型、齊墩果烷型、羽扇豆烷型等，其中環阿屯醇和羊毛甾醇也分別是植物甾醇、真菌和動物甾醇生物合成的前體。

真菌三萜主要為羊毛甾醇骨架來源的衍生物，其以羊毛甾醇為底物，在氧化酶、酰基轉移酶、糖基轉移酶等后修飾酶的催化下合成結構多樣的羊毛甾烷類三萜，如靈芝中的靈芝酸A 和靈芝酸C、茯苓中的茯苓酸和茯苓新酸B、牛樟芝中的zhankuic acid E、Astraeuspteridis中的3-epiastrapteridiol、白樺茸中的inotodiol 等［1］，因此細胞色素P450 單加氧酶、糖基轉移酶等催化酶為這些三萜化合物合成途徑后修飾階段的關鍵酶，對三萜化合物結構的多樣性發揮著重要作用。

2 細胞色素P450 單加氧酶

細胞色素P450 單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases，簡稱CYP450、P450 或CYP） 屬于超基因家族酶，是一類含有血紅素的鐵硫蛋白，能以還原態與CO 結合，在450 nm 波長處有最大吸收峰，最先在哺乳動物大鼠肝微粒體中被發現，廣泛分布在細菌、真菌、動植物、人等各種需氧生物體內［20］。P450 的命名是基于其氨基酸序列的同源性，若P450 基因的氨基酸序列同源性大于40%，則納入同一家族； 若同源性大于55%，則納入同一亞家族。

Nelson［21］研究表明，真菌的CYP 基因具有豐富的多樣性，目前已對八百多種真菌基因組進行測序，已發現的真菌CYP 基因超過85 000 條，真菌的CYP 家族結構也逐漸形成，有805 個家族，根據系統發育樹上的不同分支被分為32 個集團，包括含有3 個家族（CYP52、63、505） 的52 集團、含有7 個家族（CYP53、57、507、65、60、62、58） 的53 集團、含有5 個家族 （CYP54、506、68、69、503） 的54 集團、含有5 個家族（CYP64、66、502、501、504） 的64 集團及其他大量不屬于以上任何集團的CYP 家族，如CYP51、56、59、61、67。已分離的真菌CYP 基因多歸屬于CYP51 ～CYP66 家族［22］，其中CYP51 和CYP61的進化較為保守，功能研究較為透徹，主要參與麥角甾醇的代謝途徑［23］。

CYP 參與真菌三萜骨架修飾，如催化碳環骨架上的不同位置發生氧化反應以形成羥基、羧基、酮基、雙鍵等不飽和基團，與真菌三萜的多樣性密切相關。因此，CYP 的克隆和功能研究對解析真菌三萜生物合成途徑及增加活性物質三萜的產量具有重要的作用，但關于真菌三萜CYP 的研究相對較少，目前已報道的參與三萜骨架修飾的CYP 基因絕大多數來自于植物，詳見表1［24-25］。

表1 參與三萜結構修飾的CYP 基因

田風華［26］將真菌中的元蘑Sarcomyxaedulis參考基因組SE1 與植物中已鑒定的32 個CYP 超家族中三萜合成相關的基因進行序列比對，植物包括糙伏毛燕麥、擬南芥、百脈根、大豆、蒺藜苜蓿、烏拉爾甘草、葡萄、人參和長春花，共獲得142 個相關CYP 基因，經轉錄組結果分析，有82 個基因呈現顯著差異表達，其中有21 個參與以β-香樹酯醇為骨架的三萜氧化修飾過程，并對其在相應三萜后修飾途徑中的作用進行了預測，屬于CYP51 類型 （cyp51h10） 的CYP 基因有5 個（SE.1A1769、SE.1A3105、SE.1A6400、SE.1A8868、SE.1A8872），主要參與對β-香樹酯醇的12、13 位的氧化修飾； 屬于CYP71 類型（cyp93E1、cyp93E2、cyp93E3） 的CYP 基因有2 個（SE.1A5016、SE.1A7086），參與對β-香樹酯醇的24 位的氧化修飾，也可能參與對β-香樹酯醇的一級修飾產物槐二醇（Sophoradiol） 的氧化修飾；屬于CYP72 類型 （cyp72A63、cyp72A154、cyp72A612） 的CYP 基因有5 個（SE.1A5981、SE.1A0547、SE.1A2193、SE.1A7668、SE.1A7798），其中SE.1A5981 基因參與對β-香樹酯醇的30 位的氧化修飾，且上調表達修飾，而其他4 個基因則可能參與多種二級修飾途徑； 屬于CYP85 類型（cyp88D6） 的CYP 基因有3 個（SE.1A3202、SE.1A7455、SE.1A3577），其中SE.1A3202 和SE.1A7455 參與對β-香樹酯醇11 位的氧化修飾，而SE.1A3577 基因則參與對β-香樹酯醇的羧化修飾，三者均為一級修飾。以上研究表明，眾多的CYP 也都來源于同一個祖先，基因序列具有一定的同源性，因此在植物中報道的與三萜合成相關的CYP 基因，如朱靈英等［24］總結的植物中近100 個與三萜合成相關的CYP 基因，可以為真菌三萜CYP 基因的挖掘提供參考。

方星等［27］通過檢索NCBI 數據庫，根據已報道5 種真菌的CYP51 氨基酸序列比對后獲得了CYP51 氨基酸序列保守區域，并利用PCR 技術克隆得到靈芝CYP51 基因（Glcyp51）。農桿菌介導的轉化法實現了Gl-cyp51 在靈芝內的超量表達和靈芝三萜含量的增加。結合其他相關研究，CYP51 在三萜骨架修飾中的重要意義被普遍證實，如孫婷婷［28］在研究中利用已鑒定功能的CYP 氨基酸序列與桑黃基因轉錄組數據進行比對，篩選出7 個同源性大于55% 的CYP 候選基因，蛋白結構域分析表明這7 個候選基因全部具有P450 保守結構域，其中4 個被注釋為羊毛甾醇14α-脫甲基酶，屬于CYP51 家族； 隨后劉增才等［29-30］在此基礎上克隆得到暴馬桑黃Sanghuangporusbaumii羊毛甾醇14α-脫甲基酶基因（lanosterol14-alpha-demethylase，LSD） 的2 條cDNA 序列，分別命名為SbLSD （登錄號MN864180） 和SbLSD1 （登錄號MN640689），通過生物信息學及原核差異表達分析，表明兩條基因都屬于CYP 超家族成員，與靈芝的LSD 蛋白同源性最高（99%），高度的同源性說明SbLSD蛋白與靈芝等物種的LSD 蛋白在三萜合成過程中可能具有相似的功能。

除了通過與植物和真菌中已鑒定的三萜合成相關CYP基因氨基酸序列進行比對分析從而獲得目標真菌三萜合成相關的CYP 基因外，也有學者直接對多種目標真菌CYP 家族基因進行富集、鑒定和分析，從整體上比較和把握真菌三萜合成相關CYP 基因的共性。如Syed 等［31］首次對黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium、Phanerochaete carnosa、雙孢菇Agaricusbisporus、褐腐菌Postiaplacenta、Ganodermasp.和干朽菌Serpulalacrymans這6 種模式擔子菌富集的CYP 家族進行鑒定和進化比較分析，發現在68 個CYP 家族中富集了11 個CYP 家族基因，分別是CYP63、CYP512、CYP5035、CYP5037、CYP5136、CYP5141、CYP5144、CYP5146、CYP5150、CYP5348 和 CYP5359。CYP 系統發育分析和基因結構分析顯示，除黃孢原毛平革菌和Phanerochaetecarnosa的CYP 家族外，其余4 個菌種的CYP 家族均具有種特異性排列，表明CYP 家族在模式擔子菌中存在副同源進化； 在這6 個真菌基因組中也存在相同基因結構的CYP 序列。此前，Chen 等［32］對靈芝菌株進行全基因組測序，發現含有的219 個CYP 基因中有78 個CYP基因（包含cyp512 基因15 個、cyp5144 基因1 個） 在靈芝菌絲體到原基階段的發育過程中上調表達，并在原基階段達到最高表達水平，在子實體階段則下調表達，這些CYP基因的表達與靈芝三萜的含量變化呈正相關且與羊毛甾醇合酶基因的表達變化一致，提示這78 個CYP 基因可能與靈芝三萜的生物合成相關。Wang［33］、Yang 等［34］在此基礎上利用過表達策略和UPLC-MS 等檢測手段從靈芝菌株中分別鑒定出參與靈芝三萜生物合成的CYP 基因cyp5150l8 和cyp512u6，這是迄今為止發現的僅有的2 個參與靈芝酸生物合成后修飾CYP 基因。此外，Yang 等［34］還克隆了靈芝的NADPH-細胞色素P450 還原酶（GLCPR），該酶可以協同cyp512u6 進行靈芝三萜的催化反應，為體外研究真菌三萜CYP 基因的功能提供了試驗參照。另外，通過比較真菌不同用藥部位或不同菌種培養時的三萜成分差異，針對性地尋找與三萜合成相關基因，近年來已成為一種新的產物合成基因研究策略。在具有代表性的藥食兩用真菌茯苓中，王維皓［35］采用UHPLC-DAD-FT/MSn技術對白茯苓和茯苓皮定性分析，發現茯苓皮中三萜酸的含量明顯高于白茯苓，尤其是3，4-開環型三萜酸類化合物，為進一步探尋其成分差異的分子機制，采用轉錄組測序等技術初步篩選到56 條可能與3，4-開環型三萜酸生物合成相關的CYP450 基因，并預測3，4-開環型三萜酸可能的生物合成途徑。

3 糖基轉移酶

真菌三萜結構通過 UDP-糖基轉移酶 （ UDPglycosyltransferase，UGTs） 在羥基和或羧基上的糖基化進一步多樣化。UGTs 基因屬于超基因家族，其數量龐大、底物靈活且具有高度的專一性，能夠利用已活化的糖基供體如UDP-葡萄糖、-半乳糖、-阿拉伯糖、-鼠李糖、-木糖或-葡萄糖醛酸轉移到不同受體分子上，激活或抑制一系列化合物或者調節其溶解度，從而參與到生物體的多種調控和代謝途徑中。與P450 一樣，UGTs 的命名是基于氨基酸序列的同源性，同源性超過40%歸為同一家族，超過60%歸為同一亞家族。

近年來，基于expressed sequence tag （EST） 分析、454焦磷酸測序技術、表達譜、系統發育樹等方法，越來越多來自細菌、植物和動物的GT 基因被挖掘出來，但目前從真菌中克隆和表征的UGTs 只有數個，如來自于凍土毛霉菌的MhGT1［36］、來自Rhizopusjaponicus的UGT58A1［35］和來自Absidiacoerulea的UGT59A1［37］。郭溆等［38］采用RT-PCR 方法根據靈芝基因組中1 條可能參與靈芝三萜合成的UGT 基因轉錄本（GL2527） 克隆得到了茯苓UGT 基因并將其命名為GLUGT1，基因全長1 491 bp，編碼含有496 個氨基酸的多肽，與云芝UGTs 中EIW63452 的相似度較高（50%），其成功克隆和序列分析為進一步研究靈芝三萜或其他真菌三萜的代謝途徑奠定了基礎。

Xie 等［39］利用基因組挖掘和異源表達技術相結合的方法，從Hypocreales真菌中鑒定出4 個新的糖基轉移酶-甲基轉移酶（UGT-MT） 功能模塊，這些模塊顯示出良好的底物雜泛性和區域特異性，能夠將類黃酮、二苯乙烯類、蒽醌類、苯二醇內酯等天然產物的甲基葡萄糖基化。有學者將這些來源于真菌的底物雜泛性的UGT 應用到植物三萜的異源生物合成中，如Zhuang 等［40］通過利用來源于釀酒酵母的UGT51 來異源合成人參三萜，由于微生物中關鍵的人參糖基轉移酶的催化能力低，于是通過解析UGT51 的晶體結構并進行半理性設計，使得UGT51 體外催化原人參二醇底物生成人參皂苷Rh2 產物的效率提高了1 800 倍，將突變的UGT51 基因導入到具備原人參二醇合成途徑的釀酒酵母中進行真核表達，可將Rh2 的產量從0.003 2 mg/g 增加到0.39 mg/g 細胞干重（dry cell weight，DCW）。Dai 等［41］利用一種來自于枯草芽孢桿菌168 的具有底物雜泛性的UGT酶Bs-YjiC 來合成人參三萜，分別以原人參三醇、UDP-葡萄糖作為糖基受體和糖基供體進行體外催化反應，結果表明Bs-YjiC 能將葡萄糖基團轉移到原人參三醇的C3、C6 和C12 位的OH 上生成5 種原人參三醇型人參三萜（包括人參三萜Rh1 和4 種非天然的人參三萜）。Zhang 等［42］則利用另一種來自于枯草芽孢桿菌的具有底物雜泛性的酶UGT109A1在大腸桿菌中異源合成人參三萜，分別以人參三萜Rh1、R1、Re、Rf 及UDP-葡萄糖作為糖基受體和糖基供體進行體外催化反應，結果發現UGT109A1 可以將糖基轉移到人參皂苷Re 和R1 的C3 位OH 上，也可以將糖基轉移到人參皂苷Rf、Rh1 的C3 及C-12 位的OH 上，合成的產物中包括多種非天然的人參皂苷。以上研究揭示了不同來源的UGT酶在三萜類天然化合物生物合成中的巨大潛力，為利用底物雜泛性的GT 修飾酶進行三萜天然產物合成提供了參考。此外，UGT51 亦可催化膽固醇、谷甾醇等甾醇底物的糖基化，為甾醇類化合物的結構多樣化發揮著重要作用［43］。

除了利用來自真菌內源性UGT 合成其它物種三萜外，也有學者利用來自于其它物種的UGT 來合成真菌內源三萜，Wu 等［44］使用4 種芽孢桿菌UGTs，包括來自蘇云金芽孢桿菌GAA07 菌株的BTGT16345 和來自枯草芽孢桿菌ATCC6633 菌株的3 種UGTs （BsGT110、BsUGT398 和BsUGT489），對真菌三萜靈芝酸G （GAG） 進行生物轉化并合成了2 種新化合物GAG-3-O-β-葡萄糖苷和GAG-26-Oβ-葡萄糖苷。對于真菌三萜合成途徑中UGTs 基因元件的挖掘及其參與的具體步驟的解析尚處于初步研究階段，通過設計合成路徑、構建細胞工廠實現高效獲取三萜類化合物的方法一直是近年來的研究熱點。Wang 等［45］在對真菌釀酒酵母底盤宿主MVA 途徑及P450 表達水平優化的基礎上構建了一系列生產人參皂苷Rh2 的細胞工廠，通過提高C3-OH 的糖基化效率、增加UGTPg45 的基因拷貝數、改造UGTPg45 的啟動子提高其表達水平，并挖掘新的糖基轉移酶UGTPg45，建立了一個迄今為止人參皂苷Rh2 產量最大的酵母細胞工廠，搖瓶產量達到179.3 mg/L，10 L 發酵罐中的產量達到了2.25 g/L，該研究結果為酵母細胞工廠生產稀有天然產物，特別是糖基化產物，提供了成功的范例。

上述研究表明GTs 在三萜結構的糖基化修飾過程發揮著重要作用，因此挖掘可作用于不同三萜骨架、合成不同皂苷的GTs 并探索其結構改造、重組表達、體外催化等相關研究，將為實現三萜皂苷類化合物的高效開發提供重要數據。

4 結語和展望

真菌中含有豐富的具有多種生物活性的三萜類化合物，是發現新穎三萜的重要資源寶庫。真菌三萜的MVA生物合成途徑從乙酰輔酶A 開始，經由3 個階段，包括IPP 和DMAPP 前體物質的形成、三萜皂苷骨架的構建及調控三萜結構多樣性的后修飾過程，第三階段中參與三萜后修飾催化的CYP450s 和GTs 基因研究報道依然很少，因此挖掘真菌中可能參與到三萜合成的后修飾酶基因并解析其功能，將有利于實現真菌三萜的人工生物合成，同時也為真菌三萜產物合成途徑的解析奠定基礎。目前，可用于尋找、克隆和鑒定真菌三萜生物合成相關基因的方法已有很多種，如EST 分析可鑒定不同組織中的轉錄組和識別新基因，表達譜及系統發育分析可以鑒別候選基因，結合基因重組表達、無細胞催化及高效分析技術，可為MVA 途徑關鍵后修飾酶CYPs、GTs 等基因的挖掘提供重要手段。

本文從真菌三萜MVA 生物合成途徑切入，介紹了后修飾階段的兩大類關鍵酶CYPs、GTs 及其對三萜合成的相關研究，為真菌三萜生物合成途徑的解析、調控、重構提供了理論參考。近年來，隨著三萜化合物化學成分、藥效活性的發現和在生物醫藥產業的發展，人們對三萜類天然活性產物的重視度也在不斷提升，而在真菌三萜在已有的化學成分、藥理作用等研究基礎上探索三萜合成途徑中關鍵酶基因的克隆、表達、調控以及在細胞代謝中的作用，不僅很好地順應了這一發展需求，而且可以進一步的促進真菌三萜資源庫的挖掘和三萜MVA 途徑關鍵酶參與合成具體步驟的闡明。

除三萜外，甾醇為真菌通過MVA 途徑合成的另一類重要代謝產物，其中麥角甾醇為真菌類的特征甾體化合物，可作為維生素D2 的前體，具有代謝調節、調控激素水平、預防心血管疾病、抗腫瘤等活性［46］。麥角甾醇合成途徑為一條由多種Erg 蛋白參與、經羊毛甾醇節點的代謝途徑。erg24 基因編碼的甾醇 14α-去甲基酶 （ sterol 14αdemethylase） 催化羊毛甾醇、鈍葉醇等C-14 位的甲基發生羥基化，屬于CYP51 家族，為一類專門負責甾醇氧化的CYP450［47］。由此可見，三萜和甾醇的后修飾過程也存在一些功能相似的酶發揮三萜骨架和甾醇骨架結構多樣性的催化作用，對三萜生物合成途徑關鍵后修飾酶的挖掘也可為甾醇生物合成途徑的解析提供參考。