四氫姜黃素脂質制劑處方優化

朱 寧，凌海燕，楊安東，趙軍寧，李小芳

（1.四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041； 2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137）

四氫姜黃素是姜黃素在體內的主要活性代謝產物，具有與姜黃素類似的藥理作用，被認為是體內姜黃素的主要有效形式，是一種極具開發價值的化合物，但低水溶性限制了其活性的發揮。

在現有的提高難溶性藥物溶解度的制劑策略中，脂質制劑是改善難溶性藥物生物利用度的幾種有前景的方法之一［1］。但是由于脂質制劑復雜的體內處置過程，使得目前大部分脂質制劑的處方設計中采用的溶解度、可分散性、乳滴粒徑等簡單指標［2-3］對生物利用度的影響并不突出［4-7］，導致其體外評價結果與體內性能相關性低，成為困擾脂質制劑開發的瓶頸。脂質制劑在口服后，隨著分散和消化的進行，藥物在消化液中形成過飽和狀態［8］，可能導致藥物迅速沉淀，從而降低吸收。因此，衡量脂質制劑性能的關鍵指標是制劑在消化后保持藥物溶解或過飽和的能力。

大多數藥物吸收的主要驅動力是被動擴散，游離藥物在胃腸道的濃度越高，吸收驅動力越強。脂質制劑在體外模擬消化條件下藥物溶出曲線下面積（AUC） 可反映藥物過飽和狀態保持的程度和時間，因此能夠預示藥物吸收的程度［9］。本研究通過D-最優混料設計得到不同處方，參考簡化體外消化法［10］，以AUC 為考察指標對處方進行了篩選，以期改善現有四氫姜黃素脂質制劑研究缺乏對脂質消化的模擬的現象［11-13］。

1 材料

Zetasizer Nano ZS 納米粒度電位儀（英國Malvern 公司）； ST16R 離心機（美國Thermo Fisher 公司）； MIX-25渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）； XS205 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； HNY-303 恒溫水浴搖床（天津歐諾儀器股份有限公司）； XP-213 偏振光顯微鏡（上海天省儀器有限公司）； JEM2100 高分辨透射電鏡（日本電子株式會社）。

四氫姜黃素原料藥（實驗室自制，由天然姜黃素催化氫化并純化所得，純度≥98%）； 四氫姜黃素對照品（美國Sigma 公司，批號BCCB4086，純度99.3%）。大豆油（浙江田雨山藥用油有限公司）； 玉米油（江西益普生藥業有限公司）； 蓖麻油、橄欖油、油酸、油酸乙酯、十二烷基三甲基氯化銨 （分析純，成都市科龍化工試劑廠）；Transcutol HP ［二乙二醇單乙基醚，嘉法獅（上海） 貿易有限公司］； 吐溫85、吐溫80、吐溫20、氫氧化鈉、無水氯化鈣、聚乙二醇400 （分析純，成都市科隆化學品有限公司）； Cremophor EL （聚氧乙烯蓖麻油，南京都萊生物技術有限公司）； Cremopher RH40 （聚氧乙烯氫化蓖麻油，德國BASF 公司）； Imwitor 742 （辛癸酸單雙甘油酯，北京鳳禮精求商貿有限責任公司）； 模擬禁食人工腸液FaSSIF V2、模擬餐后人工腸液FeSSIF V2 （英國Biorelevant 公司）； 豬胰酶（8×USP，上海麥克林生化科技股份有限公司，批號C10234345）； 4-溴苯硼酸（上海源葉生物科技有限公司，純度98%，批號S06A6K2217）。鹽酸（分析純，成都金山化學試劑有限公司）； 乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；氨水 （分析純，成都長聯化工試劑有限公司，含量25% ～28%）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.05% 氨水（含10 mmol/L 十二烷基三甲基氯化銨） （38 ∶62）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長288 nm； 進樣量10 μL。

2.2 溶解度測定 采用振搖法測定四氫姜黃素在油、表面活性劑、助表面活性劑中的飽和溶解度。取過量四氫姜黃素分別加入裝有各輔料的離心管中，25 ℃、120 r/min 振搖48 h，8 000 r/min 離心10 min，精密稱取上清液0.2 g，用無水乙醇稀釋，作為供試品溶液，在“2.1” 項下色譜條件下進樣測定，結果見表1。

表1 四氫姜黃素在不同輔料中的平衡溶解度

由此可知，四氫姜黃素在長鏈油脂中溶解度普遍較低，但在蓖麻油中溶解度較高，為46.3 mg/g； 在中鏈油脂中MCT、Imwitor 742 溶解度約為12～15 mg/g； 在表面活性劑中吐溫80 溶解度最高，超過200 mg/g； 在助表面活性劑中Transcutol HP 對四氫姜黃素的溶解度達381 mg/g，遠超其他助表面活性劑。

2.3 處方的初步篩選

2.3.1 四氫姜黃素在處方中的溶解度 參考脂質制劑分類系統的典型處方［14］，并結合四氫姜黃素在輔料中的溶解度對部分輔料進行了適當調整，得到9 個空白脂質處方，見表2。按處方中各成分的比例取輔料混合均勻，制備空白處方，將過量四氫姜黃素加入裝有空白處方的離心管中，25 ℃、120 r/min 振搖48 h。按“2.1” 項下色譜條件測定四氫姜黃素在各處方中的平衡溶解度。

表2 四氫姜黃素在不同類型脂質處方中的平衡溶解度及分散后的乳滴粒徑（n＝3）

由此可知，四氫姜黃素在各處方中的溶解度與油脂比例呈負相關關系，ⅢB、Ⅳ型處方中的溶解度比Ⅰ、Ⅱ、ⅢA 型處方有大幅度提升。由于四氫姜黃素的服用劑量較高，溶解度在300 mg/mL 以上的ⅢB、Ⅳ型處方更為適合。ⅢBM 和ⅢB-L 型處方中四氫姜黃素溶解度分別為377.6、330.9 mg/g，較為接近，故對這2 種處方作進一步比較。

2.3.2 乳滴粒徑 分別將空白和載藥處方以100 倍純水稀釋并充分分散后，用激光粒度儀測定粒徑。由表2 可知，粒徑隨著脂質含量的下降而減小，且含長鏈脂質的處方的分散粒徑明顯大于含中鏈脂質處方。空白脂質處方分散后，中鏈脂質處方透明度高于同型的長鏈脂質處方，與粒徑測定結果相符。但載藥后ⅢB-M 及Ⅳ型處方則變為白色不透明乳液，經顯微鏡觀察，乳液中產生了微小的藥物結晶顆粒； ⅡM 和ⅢA-M 型則由于載藥量較小，外觀與空白處方相差不大。

2.3.3 在人工胃液中的溶出試驗 分別將1.5 g 四氫姜黃素溶于5 g ⅢB-M、ⅢB-L、Ⅳ型空白處方中，各取0.50 g裝填入0 號硬膠囊中，以人工胃液（0.01 mol/L HCl 和0.15 mol/L NaCl，pH 2.0，由于脂質處方中不含蛋白酶的底物，故未加入胃蛋白酶） 為溶出介質，采用2020 年版《中國藥典》 四部通則0931 溶出度與釋放度測定法槳法測定，轉速為75 r/min，于5、15、30、45、60、90、120 min各取樣5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，測定四氫姜黃素含量，計算溶出度，結果見圖1。

圖1 3 種處方在人工胃液中的溶出曲線

由此可知，3 種類型處方的溶出速率從快到慢為ⅢBL、ⅢB-M、Ⅳ，ⅢB-L 型可乳化分散，在15 min 時溶出度即達90%； ⅢB-M 型溶出度較低，2 h 時約為61%； Ⅳ型最終溶出度僅為38%，這是由于其載藥后黏度較大，溶出速度較慢，并且隨著其中表面活性劑和助溶劑的溶解，殘留的四氫姜黃素遇水迅速產生沉淀，導致溶出度較低。

2.3.4 ⅢB-M、ⅢB-L 處方體外消化比較 為了模擬四氫姜黃素-脂質制劑在體內消化過程，參考文獻［14］ 報道，分別采用模擬禁食腸液和模擬餐后腸液為介質，并加入豬胰酶以模擬餐前和餐后狀態下處方在腸道的消化過程。

將0.42 g NaOH、3.44 g NaHPO4、6.19 g NaCl 溶于0.9 L 純凈水中，調節pH 至6.5，純凈水補足體積至1 L，得緩沖液。將2.24 g 模擬禁食腸液粉末溶解于緩沖液中，即得模擬禁食腸液； 將4.04 g NaOH、8.65 g 冰醋酸、11.87 g NaCl 溶于0.9 L 純凈水中，調節pH 至6.5，補足體積至1 L，即得緩沖液； 將11.2 g 模擬餐后腸液粉末溶于緩沖液中，即得模擬餐后腸液； 分別在2 種介質中加入0.5%豬胰酶、氯化鈣27.7 mg，渦旋1 min，即得消化介質，組成見表3。

表3 模擬禁食和餐后消化液組成

分別取“2.3.3” 項下含藥處方0.50 g，加入37 ℃、含50 mL 模擬腸液消化液的離心管中，60 r/min 振搖，于0、0.25、0.5、1、1.5、2 h 各取消化液0.5 mL，加入0.5 mmol/mL 4-溴苯硼酸甲醇10 μL，搖勻，終止脂解反應［15］，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

由圖2 可知，在消化體系中，四氫姜黃素濃度達到高峰后均有下降趨勢，這是由于處方在快速分散達到過飽和后產生沉淀所導致的。在模擬禁食腸液中，ⅢB-L 型溶出AUC 高于ⅢB-M 型，這與模擬胃液中的溶出試驗結果一致。而在模擬餐后腸液中，ⅢB-L 型與ⅢB-M 型的AUC 差異較小，可能是由于模擬餐后腸液中具有更高濃度的膽鹽、磷脂及脂質消化產物［16］，對四氫姜黃素的溶解度增大導致，提示四氫姜黃素的脂質處方可能具有正向食物效應［17］，即餐后給藥可增加其生物利用度。綜合M、L 型處方在2 種消化介質中的表現，選擇長鏈的蓖麻油作為脂質，對四氫姜黃素溶解度更高的模擬餐后腸液作為脂解試驗的介質。

圖2 ⅢB-M、ⅢB-L 型處方溶出曲線

2.4 D-最優混料設計 根據四氫姜黃素在各型處方中的溶解度結果可知，當蓖麻油比例為25%時（ⅢB 型），載藥量可達330 mg/g，因此預估蓖麻油比例≤0.3 時，載藥量將大于300 mg/mL。結合Pouton［1］對各類脂質制劑處方組成的界定（表4），將表面活性劑吐溫80 范圍設置為0.2 （Ⅲ型處方下限） ～0.8 （Ⅳ型處方上限），助表面活性劑Transcutol HP 比例≤0.5。通過Design Expert 12 軟件進行D-最優混料設計，結果見表5。

表4 脂質制劑處方分類

表5 D-最優混料設計結果

按表5 的處方比例制備空白脂質處方，并在處方中加入過量四氫姜黃素，25 ℃下振搖48 h，8 000 r/min 離心10 min，按“2.3.4” 項下方法進行體外消化試驗，于0.25、0.5、1、2、3、4 h 各取消化液0.5 mL，加入0.5 mmol/mL 4-溴苯硼酸甲醇溶液10 μL，搖勻，終止脂解反應，0.22 μm 微孔濾膜過濾，測定四氫姜黃素質量濃度。通過Prism 8.0 軟件繪制時間-濃度曲線，見圖3，計算曲線下面積AUC，結果見表5。

圖3 各處方體外消化試驗溶出曲線

通過Design Expert 12 軟件對表5 數據進行回歸擬合，得方程為AUC＝-139.98A＋846.38B＋275.09C-1 547.80AB-51.65AC- 1 673.94BC＋4 354.12A2BC＋8 010.82AB2C＋3 585.47ABC2（R2＝0.983 8），方差分析見表6。由此可知，失擬項P＝0.272 7，R2＝0.989 3，，表明模型擬合程度較好，能較準確地預測評價指標； 當A為0.076，B為0.800，C為0.124 時，AUC 達到峰值，為435.6 mg/（mL·min）。溶解度最佳擬合方程為溶解度＝-1 943.4A＋78.41B-679.57C＋3 315.32AB＋6 395.61AC＋3 510.66BC-12 512.57ABC（P＜0.01）。輔料比例取AUC優化值時，溶解度的預測值為346.52 mg/g。

表6 方差分析結果

由等高線圖（圖4） 可知，四氫姜黃素在處方中的飽和溶解度與油脂的比例量具有負相關關系，但AUC 與輔料比例的關系更為復雜，AUC 隨表面活性劑比例增加而增加，但當表面活性劑的量一定時，油脂和助表面活性劑其中之一偏大，AUC 會明顯降低。

圖4 溶解度（A）、AUC （B） 等高線圖

2.5 驗證試驗 按預測的最優處方進行輔料的配制，加入過量四氫姜黃素混合，振搖48 h 以達到飽和濃度，取離心后的載藥處方，進行消化試驗，測定其體外釋放濃度，重復3 次，結果見表7。由此可知，驗證試驗與模型預測相符，模型重復性和預測性良好。

表7 驗證試驗結果（n＝3）

2.6 載藥量研究 將“2.5” 項下所得飽和載藥量的含藥最優處方混合，添加空白輔料稀釋混勻，制得載藥量分別為飽和載藥量20%、40%、60%、80%、100% （71、142、213、284、355 mg/g） 的處方F20～F100，按“2.3.4” 項下方法進行消化試驗，測定消化液中四氫姜黃素質量濃度。

由圖5A 可知，在4 h 的消化過程中，F20、F40 在質量濃度達到最高后幾乎保持不變； F60 在60 min 達到最高后緩慢降低； F80、F100 在60 min 達到峰值后迅速下降，4 h后甚至接近F20。釋放曲線AUC 順序為F100、F60、F80、F40、F20，F60～F100 的AUC 差距不大（圖5B）。這是由于四氫姜黃素在體系中的過飽和度較低時，可以較長時間保持亞穩態，但過飽和度越高，藥物聚集速度越快，形成沉淀速度也加快，導致更快接近平衡濃度（圖6）。這一結果提示，藥物在消化液中的高過飽和度會帶來較大的沉淀風險，可能導致其在體內的暴露低于預期。綜上所述，暫定載藥量為60%飽和載藥量，即213 mg/g。

圖5 不同載藥量四氫姜黃素脂質制劑在體外消化時的溶出曲線（A） 和AUC （B）

圖6 載藥量對消化4 h 后四氫姜黃素質量濃度的影響

3 討論

本研究以四氫姜黃素的脂質處方在簡化體外脂解模型中的濃度-時間曲線下面積為指標，采用D-最優混料設計優選了脂質處方，結果表明以蓖麻油、吐溫80、Transcutol HP 質量比為7.6 ∶80 ∶12.4 時，脂質處方具有最大的體外脂解試驗曲線下面積。在此基礎上通過體外消化試驗對最佳載藥量進行了初步摸索。

本研究采用體外AUC 作為衡量制劑性能的指標，為脂質制劑的處方研究提供了一種新的手段； 改進了簡化脂解試驗的方法，讓處方的分散在脂解過程中進行，能夠同時考察處方的分散性能； 讓被考察處方以各自的飽和載藥量進行脂解試驗。因此，就使脂質制劑體外脂解試驗中的AUC 成為綜合指標，考察了處方的分散性能、載藥量、在分散和消化時保持藥物過飽和的能力，比通常采用的溶解度、乳滴粒徑、乳化時間等簡單指標更能反映制劑在體內的性能。

在脂解試驗中溶出曲線普遍顯示出先升后降的趨勢，這是由于藥物在初始階段快速溶出，濃度迅速升高，隨后由于過飽和狀態的不穩定而發生沉淀，導致濃度下降，被稱為“彈簧-降落傘” 過程［18-19］，是脂質制劑等過飽和制劑釋藥的一個共同特點。正是由于這種不規則的釋藥曲線，使得AUC 而非溶出度成為一個衡量脂質制劑性能的良好指標。

本研究發現，載藥量與體外AUC 并不呈完全的等級相關，這可能與試驗條件有關。如果增大介質用量，會減小體系的過飽和度，降低沉淀速度，從而使AUC 等級與載藥量趨于一致； 若采用較短的消化時間（30～60 min），載藥量與AUC 呈較好的等級相關。但本研究采用50 mL 消化液體積及4 h 消化時長能更準確地反映胃腸道的生理狀態，其試驗結果也更好地體現了脂質處方體內表現的復雜性。但當載藥量達到飽和濃度60%以上時，載藥量與體內暴露量的關系難以根據本實驗預測，需要進一步結合體內生物利用度、藥效學研究結果進行確認。