基于IL-6 介導的JAK1/STAT3 信號通路探討竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠的改善作用

陳云坤，王 杰，李秀華，張文斌*

（1.重慶市中醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶 400011； 2.重慶市中醫院呼吸內科，重慶 400011）

呼吸系統疾病給全世界帶來了巨大的健康負擔，每年有3 億人患COPD，導致多達300 萬人死亡，是全球第三大死因。然而，COPD 的發病機制尚未完全闡明，研究表明其與吸煙、職業粉塵和化學品、空氣污染、氣道上皮細胞慢性炎癥、氧化應激反應增強、蛋白酶和抗蛋白酶系統失衡有關，整個過程與許多細胞因子和信號通道有關［1-3］。有研究表明，多種炎癥細胞可以在COPD 機制下釋放炎癥因子和炎癥趨化因子，通過信號轉導子以及轉錄激活子通路（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT） 信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應等病理生理機制［4］。吸煙或感染等外界刺激會激活氣道上皮細胞釋放大量炎癥介質，造成體內中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥相關細胞以活性狀態聚集于氣道內，進而與JAKs 受體結合激活JAK1/STAT3 信號通路，促進COPD 炎癥反應復發，導致呼吸道、肺組織以及血管的損傷，并產生一系列呼吸道臨床癥狀引起COPD 急性發作［5-7］。本研究通過建立COPD 大鼠模型，給予竹葉石膏湯合清氣化痰丸進行干預，通過對大鼠肺功能以及相關蛋白表達進行檢測，探討竹葉石膏湯合清氣化痰丸治療COPD 發病的潛在機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠48 只，10～12 周齡，體質量（200±50） g，購自湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （湘） 2019-0004］，飼養于重慶市中醫院實驗動物中心［實驗動物使用許可證號SYXK （渝） 2020-0001］，室溫（23±2）℃，相對濕度（60±5）%，清潔通風，自由飲水進食，適應性喂養7 d。動物實驗經重慶市中醫院倫理委員會批準（倫理號2017-KY-12）。

1.2 藥物 竹葉石膏湯合清氣化痰丸由淡竹葉15 g、生石膏30 g、法半夏15 g、麥冬20 g、人參10 g、甘草6 g、黃芩10 g、瓜蔞子30 g、膽南星12 g、陳皮15 g、苦杏仁10 g、枳實15 g、魚腥草30 g、浙貝母10 g、竹茹15 g 組成，按照劑量分成三等分，參考臨床等效劑量換算為高劑量，確定低、中、高劑量分別為5、10、15 g/kg。各藥材根據以上比例配制后加水煎煮2 次，調至生藥量2 g/mL，于冰箱中冷藏備用。

1.3 試劑 Superscript ⅡRT、SYBR Green 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號18064014、11735032）；MaxVisionTM試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，批號KIT-5002）； 二氨基聯苯胺（北京百奧萊博科技有限公司，批號QN1149-DGR）； IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3 抗體（英國Abcam 公司，批號ab6672、ab125051、ab31370、ab16030）。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠按隨機數字表法分為正常組，模型組，中藥低、中、高劑量組及中藥低、中、高劑量＋伊他替尼組，每組6 只。采用氣道滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 聯合煙熏方法建立COPD 模型，在自制50 cm×40 cm×40 cm 玻璃吸煙染毒箱內加20 支香煙煙絲混合點燃煙熏，每天2 次，每次30 min，隔2 d 休息1 次，第1、14天，每只大鼠氣道內滴入200 μL 1 g/L LPS，當天不予以吸煙； 正常組大鼠置于吸煙染毒箱內呼吸正常空氣，氣道內滴入0.2 mL 生理鹽水。造模28 d 后開始給藥，中藥低、中、高劑量組分別每天灌胃給予5、10、15 g/kg 竹葉石膏湯合清氣化痰丸（1.4 mL/100 g）； 中藥低、中、高劑量＋伊他替尼組分別灌胃給予相應劑量竹葉石膏湯合清氣化痰丸，同時皮下注射30 mg/kg伊他替尼； 正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，連續給藥2 周。

2.2 肺功能檢測 采用大鼠肺功能檢測儀測量大鼠呼氣峰流速 （peak expiratory flow，PEF）、吸氣峰流速 （peak inspiratory flow，PIF）、分鐘通氣量（minute volume，MV）。

2.3 HE 染色觀察肺組織病理形態 大鼠肺組織用含4%多聚甲醛的PBS 溶液在4 ℃下固定24 h，石蠟包埋后切成3 μm 薄片，脫蠟脫水，蘇木精和伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察組織形態，并拍攝照片。

2.4 RT-qPCR 法檢測肺組織IL-6、JAK1、STAT3 和SOCS3 mRNA 表達 收集各組大鼠肺組織，采用TRIzol 法提取組織總RNA，隨后使用Superscript ⅡRT 試劑將RNA 逆轉錄成cDNA。配制反應體系（0.5 μL Template DNA、10 μL SYBR Green、0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ、正反向引物各0.8 μL、雙蒸水補充體積至20 μL） 進行擴增反應，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環，通過2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 免疫印跡法檢測肺組織IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3蛋白表達 使用RIPA 試劑裂解大鼠肺組織，提取總蛋白，BCA 法定量，95 ℃加熱5 min 進行變性。制備10% SDSPAGE 凝膠，每條泳道上樣30 μg 蛋白，電泳分離后將其轉移到PVDF 膜上，封閉，加稀釋的一抗孵育1 h，然后加二抗孵育1～2 h，通過增強的化學發光試劑顯色，通過Image J 1.8.0 軟件分析蛋白條帶和內參β-actin 的光密度值，以兩者比值表示蛋白相對表達。

2.6 免疫組化法檢測肺組織IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3蛋白表達 采用4%多聚甲醛固定大鼠肺組織，脫水后石蠟包埋，制備5 μm 切片，脫蠟、水合后將載玻片與3% H2O2孵育10 min，與0.1%胰蛋白酶孵育20 min，滴加一抗，在4 ℃下孵育過夜，次日與HRP-聚合物偶聯的二抗在37 ℃下孵育1 h，DAB 染色3 min，蘇木精復染細胞核，于倒置顯微鏡下觀察，陽性染色為棕黃色。通過Image J 軟件分析肺組織蛋白的平均光密度（AOD） 值（累計光密度/有效目標分布區域面積），其數值越大，蛋白陽性表達越高。

2.7 統計學分析 通過Graphpad Prism 8.0.1 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺功能的影響 與正常組比較，模型組大鼠PIF、PEF、MV 降低（P＜0.05）； 與模型組比較，中藥各劑量組和中藥各劑量＋伊他替尼組PIF、PEF 升高（P＜0.05），中藥中、高劑量組和中藥各劑量＋伊他替尼組MV 升高（P＜0.05）； 與中藥各劑量組比較，中藥各劑量＋伊他替尼組PIF、MV 降低 （P＜0.05）； 與中藥中、高劑量組比較，中藥中、高劑量＋伊他替尼組PEF 降低（P＜0.05），見表2。

表2 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺功能的影響（±s，n＝6）

表2 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺功能的影響（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，▲P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05； 與中藥低劑量組比較，＃P＜0.05； 與中藥中劑量組比較，＆P＜0.05； 與中藥高劑量組比較，ΔP＜0.05。

組別PIF/（mL·s-1）PEF/（mL·s-1）MV/mL正常組5.42±0.163.01±0.0743.48±1.91模型組1.20±0.07▲1.63±0.10▲22.71±1.88▲中藥低劑量組2.28±0.18*2.01±0.10*30.67±1.33中藥中劑量組3.50±0.24*＃2.40±0.19*＃35.23±0.84*＃中藥高劑量組3.88±0.07*＆2.65±0.06*41.33±1.14*＆中藥低劑量＋伊他替尼組1.84±0.09*＃1.88±0.11*25.03±0.84*＃中藥中劑量＋伊他替尼組2.02±0.10*＆2.01±0.23*＆29.29±1.04*＆中藥高劑量＋伊他替尼組2.34±0.15*Δ2.09±0.09*Δ33.70±1.65*Δ

3.2 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織形態學的影響 如圖1 所示，正常組大鼠肺組織清晰可見，支氣管壁結構較規則，無明顯損傷，僅見少量炎性細胞浸潤，并且未觀察到黏液栓、黏液、黏膜充血水腫等； 模型組大鼠肺組織多處腺體增生，大量炎性細胞浸潤，管壁增厚，肺泡壁結構嚴重受損、變薄、破裂，繼而導致肺大泡形成，肺泡數量減少； 與模型組比較，中藥中、高劑量組大鼠肺組織病理損傷明顯得到改善，支氣管壁變薄、局部脫落，炎癥細胞浸潤和充血水腫減輕，肺大泡減少，并且肺泡腔的破壞、擴張和融合得到緩解； 中藥中、高劑量＋伊他替尼組大鼠肺泡擴張和融合得到改善，炎癥細胞浸潤和黏膜充血減少，以中藥高劑量＋伊他替尼組更優。

圖1 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織形態學的影響（HE，×400）

3.3 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 和SOCS3 mRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 mRNA 表達升高（P＜0.05），SOCS3 mRNA 表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，中藥各劑量組大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 mRNA表達降低（P＜0.05），SOCS3 mRNA 表達升高（P＜0.05）；與中藥各劑量組比較，中藥各劑量＋伊他替尼組IL-6、JAK1、STAT3 mRNA 表達升高（P＜0.05），SOCS3 mRNA 表達降低（P＜0.05），見表3。

表3 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 和SOCS3 mRNA 表達的影響（±s，n＝3）

表3 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 和SOCS3 mRNA 表達的影響（±s，n＝3）

注： 與正常組比較，▲P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05； 與中藥低劑量組比較，＃P＜0.05； 與中藥中劑量組比較，＆P＜0.05； 與中藥高劑量組比較，ΔP＜0.05。

組別IL-6JAK1STAT3SOCS3正常組1.00±0.011.00±0.031.00±0.091.00±0.02模型組8.09±0.32▲8.08±0.32▲8.07±0.30▲0.15±0.01▲中藥低劑量組6.14±0.12*6.05±0.27*6.21±0.40*0.38±0.01*中藥中劑量組4.31±0.17*＃4.13±0.10*＃4.06±0.29*＃0.72±0.05*＃中藥高劑量組2.03±0.06*2.04±0.03*＆1.97±0.18*＆0.88±0.03*＆中藥低劑量＋伊他替尼組8.11±0.20＃7.71±0.45＃8.11±0.28＃0.16±0.01＃中藥中劑量＋伊他替尼組7.17±0.12*＆7.02±0.13＆6.90±0.30＆0.24±0.01＆中藥高劑量＋伊他替尼組6.22±0.04*Δ6.35±0.35*Δ6.15±0.21*Δ0.41±0.03*Δ

3.4 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 和SOCS3 蛋白表達的影響

3.4.1 免疫印跡檢測 如圖2 所示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 蛋白表達升高 （P＜0.05），SOCS3 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，中藥各劑量組大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3 蛋白表達降低（P＜0.05），SOCS3 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與中藥各劑量組比較，中藥各劑量＋伊他替尼組IL-6、JAK1、STAT3蛋白表達升高 （P＜0.05），SOCS3 蛋白表達降低 （P＜0.05）。

圖2 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織IL-6、JAK1、STAT3、SOCS3 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.4.2 免疫組化檢測 如圖3 ～6 所示，正常組IL-6、JAK1、STAT3 陽性表達較少，IL-6 主要表達于細胞核，SOCS3 陽性表達較強，呈深褐色，SOCS3 主要在細胞質中表達。與正常組比較，模型組IL-6、JAK1、STAT3 陽性表達最多，IL-6 主要在細胞核和細胞質表達，JAK1、STAT3定位于細胞核或細胞質，SOCS3 呈弱陽性表達； 與模型組比較，中藥各劑量組IL-6、JAK1、STAT3 陽性表達減少，IL-6、JAK1、STAT3 主要表達于細胞質或細胞核，SOCS3陽性表達增強，主要定位于細胞質或質膜； 與中藥各劑量組比較，中藥各劑量＋伊他替尼組IL-6、JAK1、STAT3 陽性表達增加，SOCS3 陽性表達減少。與正常組比較，模型組IL-6、JAK1、STAT3 的AOD 值升高（P＜0.05），SOCS3 的AOD 值降低（P＜0.05）； 與模型組比較，中藥各劑量組IL-6、JAK1 的AOD 值降低（P＜0.05），中藥中、高劑量組STAT3 的AOD 值降低（P＜0.05），SOCS3 的AOD 值升高（P＜0.05）； 與中藥各劑量組比較，中藥各劑量＋伊他替尼組IL-6 的AOD 值升高（P＜0.05）； 與中藥高劑量組比較，中藥高劑量＋伊他替尼組SOCS3 的AOD 值降低（P＜0.05）。

圖3 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織IL-6 表達的影響（免疫組化，×400，±s，n＝3）

圖4 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織JAK1 表達的影響（免疫組化，×400，±s，n＝3）

圖5 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織STAT3 表達的影響（免疫組化，×400，±s，n＝3）

圖6 竹葉石膏湯合清氣化痰丸對COPD 大鼠肺組織SOCS3 表達的影響（免疫組化，×400，±s，n＝3）

4 討論

COPD 是臨床上常見的呼吸系統疾病之一，以持續氣流受限為主要表現，伴隨呼吸困難、咳嗽、咳出黏液（痰）和喘息，嚴重影響患者的生存與生活質量［8-10］。炎癥因子在COPD 的發生發展中起主導作用，涉及多種炎癥細胞、細胞因子和炎癥介質，包括中性粒細胞、巨噬細胞、T 淋巴細胞、IL-6、L-8 和腫瘤壞死因子-α 等，其中IL-6 是COPD 氣道炎癥中的重要促炎因子，在COPD 患者痰液、肺實質和血液中都發現IL-6 不同程度的升高［11-12］。

本研究發現，中藥各劑量組均能改善COPD 模型大鼠肺功能，緩解肺氣流受限、通氣功能障礙，并減緩肺組織疾病和支氣管壁炎癥，同時還發現，IL-6、JAK1、STAT3 mRNA 和蛋白表達在COPD 大鼠肺組織中均升高，說明COPD 的發生發展與JAK1/STAT3 的持續激活和過表達及肺組織信號轉導通路異常密切相關。STAT3 的激活水平與IL-6 表達呈正相關。以往研究也表明，STAT3 在肺泡上皮細胞中可被IL-6 激活，導致STAT3 持續激活和過度表達，與氣道炎癥和肺氣腫的發生密切相關［13-14］。許光蘭等［15］研究發現，清金化痰顆粒可下調COPD 急性期大鼠STAT3 過度表達，抑制IL-6 表達的升高，減輕氣道炎癥。此外，王成陽等［16］研究也發現，JAK1、STAT3、p-STAT3 在COPD 大鼠模型中過度表達，JAK1 活化后，迅速激活STAT3 使其磷酸化，p-STAT3 反過來又促進炎癥因子表達的升高，進而加重COPD。在煙熏和LPS 聯合誘導下，大鼠肺組織中促炎因子IL-6 表達增加，結合細胞表面的IL-6R，進一步誘導JAK1 磷酸化。JAK1 激活迅速與STAT3 結合使STAT3 磷酸化并被激活。此外，有研究表明，抑制STAT3 后，能夠導致LPS 誘導的IL-6 基因及蛋白表達降低［17］。本研究結果表明，竹葉石膏湯合清氣化痰丸通過下調JAK1、STAT3 蛋白表達，抑制其過度表達，緩解大鼠肺部組織炎癥，降低IL-6 炎癥因子表達，抑制JAK1/STAT3 通路。

本研究還表明了竹葉石膏湯合清氣化痰丸可上調SOCS3 基因和蛋白表達。JAK/STAT 信號通路的IL-6 依賴性激活受到SOCS 蛋白家族成員的嚴格調控，SOCS1/SOCS3上調的快速反饋有效抑制生理條件下STAT3 的磷酸化，目前普遍認為SOCS3 是STATs 的靶基因，能夠直接抑制STATs 的活化［13，18］。最新研究發現，IL-6 能夠與JAK/STAT信號通路上的受體結合引起炎癥反應并可啟動SOCS3 基因表達，起負反饋調節作用［19-20］。本研究結果還表明，添加伊他替尼后會抑制竹葉石膏湯合清氣化痰丸提升肺功能和抑制炎癥相關基因和蛋白表達的能力。本研究初步表明，竹葉石膏湯合清氣化痰丸可能通過調控IL-6 介導的JAK/STAT 通路減緩COPD 炎癥和發作。