基于網絡藥理學和動物實驗探討萱草花抗阿爾茨海默病的作用機制

徐夢潔，肖 姣，張曉瑩，剛芳莉，楊欣超，顏廷旭*

（1.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000； 2.沈陽藥科大學無涯創新學院，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院，遼寧 沈陽 110016）

全球范圍內約有5 000 萬老年人患有癡呆癥，阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） 是最常見的類型［1-2］。目前AD 藥物的主要作用集中于延緩發病進程，無法改善或治愈AD［3-4］。中藥由于其多靶點、多途徑的優勢，成為了抗AD 藥物研究的焦點［5-7］。

萱草花為百合科萱草屬植物黃花萱草Hemerocallis citrinaBaroni 的花蕾部分，為藥食兩用資源［8］。現代藥理研究表明，萱草花具有抗炎、神經保護等作用，可改善抑郁并發的記憶力損傷，但其抗AD 作用機制尚無系統報道［9-10］。

網絡藥理學是一種基于系統生物學理論，結合計算機科學，從整體研究探討藥物和疾病的相關性，為藥物研究提供理論基礎的分析方法［11-13］。本研究旨在利用網絡藥理學分析，結合動物實驗驗證，探究萱草花抗AD 的潛在作用及機制，為相關藥物的進一步開發提供科學參考。

1 材料

1.1 動物 50 只10 月齡SPF 級雄性昆明小鼠，體質量18～22 g，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司［質量合格證編號110324231100154563，實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2019-0010］，飼養于康泰醫學檢驗服務河北有限公司［實驗動物使用許可證號SYXK （冀） 2021-006］，環境溫度（22±1）℃，相對濕度45% ～55%，12 h/12 h 光暗循環，自由進食飲水，適應性飼養1 周。動物研究經康泰醫學檢驗服務河北有限公司動物倫理會批準（倫理號MDL-2023-01-11-2）

1.2 試劑與藥物 萱草花由念之安生物技術有限公司提供（批號B20211019，總黃酮含量12 mg/g，70% 乙醇加熱回流提取2 次，每次2 h）。脂多糖（LPS，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號GC205009）； 多奈哌齊（上海源葉生物科技有限公司，批號S70192）； 重組beta Amyloid1-42（Aβ1-42） 抗體 ［艾博抗 （上海） 貿易有限公司，批號ab201060］； 膠質纖維酸性蛋白 （glial fibrillary acidic protein，GFAP）、白介素1β （interlenkin 1β，IL-1β） 抗體（美國CST 公司，批號80788、12242）； HRP 標記羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，批號SA00001-2）。

2 方法

2.1 網絡藥理學研究

2.1.1 萱草花活性成分、靶點篩選 以 “Hemerocallis citrinaBaroni” 為關鍵詞，從公共數據庫搜索萱草花化學成分，通過PubChem 數據庫（https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 獲得結構，利用SwissADME （http： //www.swissadme.ch/index.php ）、TCMSP （ https： //tcmsp-e.com/tcmsp.php） 進行篩選，并建立數據庫。通過Swiss Target Prediction 預測活性成分作用靶點，利用UniProt（https： //www.uniprot.org/） 校正名稱，合并各活性成分靶點后刪除重復數據。

2.1.2 AD 靶點及交集靶點獲取 通過OMIM （https： //omim.org/）、GeneCards （https： //www.genecards.org/）數據庫篩選“Alzheimer disease” 靶點，構建疾病靶點數據庫，繪制AD 與萱草花的交集靶點。

2.1.3 “活性成分-AD” 網絡構建 通過Cytoscape 3.7.2軟件可視化“萱草花活性成分-AD” 網絡，連接的節點越密集，受該成分調控的靶點越多，即該成分是萱草花抗AD的重要活性成分。

2.1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI） 網絡構建及關鍵靶點篩選 將交集靶點導入STING 11.0 數據庫（https： //cn.stringdb.org） 進行分析，模式設置為多種蛋白，物種限定為“Homosapiens”。

2.1.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 利用R3.6.0 軟件進行GO 功能富集分析，從靶細胞的分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular component，CC） 和生物過程（biological process，BP） 確定基因富集的功能，P值與富集程度呈正相關，選取篩選校正后P＜0.05 的結果，繪制相應氣泡圖。利用KEGG 途徑富集分析獲得樞紐靶點作用的途徑，將結果繪制成相應氣泡圖。

2.1.6 分子對接 利用分子對接模擬軟件對7 種活性成分與篩選得到的核心靶點與PI3KR1 蛋白靶點進行對接，將結果利用Plymol 軟件進行可視化處理。

2.2 動物實驗

2.2.1 模型制備 將小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組和萱草花低、高劑量組（400、800 mg/kg，質量濃度分別為40、80 mg/mL），每組10 只。將萱草花溶于CMCNa 中，其中給藥組灌胃給予相應劑量藥物，對照組灌胃給予等體積CMC-Na 溶液。

2.2.2 行為學實驗檢測學習記憶力 采用Y 迷宮實驗，記錄6 min 內小鼠對迷宮臂的探索情況，若連續3 次進入3 個臂則認為完成1 次正確交替反應，自發交替率＝ ［正確交替反應次數/（總進臂次數-2）］ ×100%。

2.2.3 HE 染色觀察腦組織病理變化 每組取3 只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛進行心臟灌流，取出完整腦組織，浸泡在磷酸鹽緩沖液中48 h，脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），用蘇木精和伊紅染色，在顯微鏡下觀察病理變化。

2.2.4 免疫組化檢測腦組織Aβ、IL-1β、GFAP 表達 取小鼠腦組織切片，放入60 ℃恒溫烘箱中2 h，脫蠟，經抗原修復、封閉后加一抗Aβ、IL-1β、GFAP 孵育過夜，次日加二抗37 ℃孵育。使用AXIOCam 50 相機獲得顯微照片，Image Pro Plus 6.0 版軟件進行分析。

2.2.5 統計學分析 通過GraphPad Prism 7 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學研究

3.1.1 活性成分作用靶點 結合文獻及TCMSP 數據庫檢索結果，得到活性成分7 種（表1），將其SMILES 導入Swiss Target Prediction 數據庫進行靶點預測，共獲得457 個作用靶點，去除重復靶點后得到149 個活性成分作用靶點。

表1 萱草花活性成分信息

3.1.2 活性成分靶點與AD 靶點交集分析 通過GENE Cards、OMIM 數據庫檢索到AD 疾病相關的靶點基因共13 240 個，對兩者取交集后獲得交集靶點基因125 個，見圖1。

圖1 萱草花活性成分與AD 疾病共同靶標韋恩圖

3.1.3 活性成分-作用靶點網絡構建 運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-靶標” 網絡圖，見圖2。其中，黃色橢圓節點代表萱草花，紅色菱形節點代表萱草花中7種活性成分，紫色橢圓節點代表潛在靶點，節點之間的線代表活性成分與作用靶點之間的相互作用，共包含133 個節點和352 個連接。

圖2 萱草花活性成分-靶點網絡圖

3.1.4 PPI 網絡分析及核心靶點篩選 將125 個萱草花與AD 的交集靶點輸入 STRING，設置 minimum required interaction score 為0.7，并隱藏網絡中斷開連接的節點，構建PPI 網絡，見圖3，共獲得290 條連線。再通過CytoHubba 的MCC 對核心靶點進行計算，獲得排名前二十者，見圖4。

圖3 PPI 網絡

圖4 核心靶點基因網絡圖

3.1.5 GO 及KEGG 富集分析 將125 個共同靶點進行GO功能富集分析，發現活性成分作用靶點富集在1 141個BP，主要包括細胞對化學刺激的反應、細胞死亡的調節、對刺激的反應、程序性細胞死亡的調控等； 98 個CC，主要包括膜結合細胞器、囊泡、膜結合細胞器等； 138 個MF，主要包括催化活性、蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、離子結合等，見圖5A。

圖5 GO 功能（A）、KEGG 通路（B） 富集分析

對萱草花與AD 的交集靶點進行KEGG 通路富集分析，篩選出10 條信號通路包括氮代謝、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路、NF-κB 信號通路、MAPK 信號通路等，見圖5B。

3.1.6 分子對接 將KEGG 通路位于PI3K/Akt 通路的核心蛋白（包括KDR、PIK3R1、PKT2、RAF1、VEGFA1） 與7 種活性成分進行分子對接，結合能越低，結合越穩定。結果，除香草酸以外其余6 種活性成分均與PIK3R1 蛋白表現出了良好的結合，見表2 和圖6。

圖6 分子對接圖

表2 核心活性成分與核心蛋白PIK3R1 的結合能

3.2 藥理實驗

3.2.1 萱草花對AD 小鼠學習記憶力的影響 如圖7A 所示，與空白組比較，模型組小鼠在Y 迷宮中的自發交替行為減少（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組自發交替率（P＜0.05）。如圖7B 所示，各組小鼠總進臂次數無明顯變化（P＞0.05）。

圖7 萱草花對AD 小鼠學習記憶力的影響（±s，n＝10）

3.2.2 萱草花對AD 小鼠腦組織病理學的影響 如圖8 所示，空白組小鼠海馬神經元排列有序、緊密，核固縮現象較少； 模型組小鼠海馬區神經元排列無序，核固縮神經元數量增加； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組可改善LPS 誘導的核固縮現象。

圖8 萱草花對小鼠神經元病理變化的影響

3.2.3 萱草花對小鼠腦組織Aβ 表達的影響 如圖9 所示，空白組小鼠海馬區可見少量Aβ 沉積； 與空白組比較，模型組小鼠海馬區Aβ 沉積水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組小鼠海馬區Aβ 沉積減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 萱草花對小鼠腦組織Aβ 表達的影響（±s，n＝3）

3.2.4 萱草花對小鼠腦組織IL-1β 表達的影響 如圖10 所示，與模型組比較，LPS 組小鼠海馬區IL-1β 表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花各劑量組小鼠海馬區IL-1β 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 萱草花對小鼠腦組織IL-1β 表達的影響（±s，n＝3）

3.2.5 萱草花對小鼠腦組織GFAP 表達的影響 如圖11 所示，與空白組比較，模型組小鼠海馬區GFAP 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花各劑量組小鼠海馬區星形膠質細胞的激活情況得到了一定的緩解，但GFAP 水平無明顯變化（P＞0.05）。

圖11 萱草花對小鼠腦組織GFAP 激活的影響（±s，n＝3）

3.2.6 萱草花對小鼠腦組織PI3K/Akt 信號通路蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、p-Akt蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，多奈哌齊組和萱草花高劑量組小鼠腦組織p-Akt 蛋白表達降低 （P＜0.05），萱草花高劑量組小鼠腦組織PI3K 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖12。

圖12 萱草花對小鼠腦組織PI3K/Akt 通路蛋白表達的影響（±s，n＝3）

4 討論

中醫將AD 歸于“癡呆” “健忘” 范疇，認為肝郁氣滯，內生毒邪，上阻腦絡，易致癡呆［14］。萱草花可改善抑郁誘發的記憶力損傷，通過疏肝解郁、調暢氣機發揮治療“健忘” 的作用［15］。

網絡藥理學分析表明，萱草花的抗AD 活性可能與炎癥信號通路相關，這也與先前的研究報道相一致［16］。腹腔注射LPS 可以通過外周炎癥誘導腦部神經炎癥的發生，整體破壞模型動物的炎癥平衡體系而造成神經損傷，是一種典型的AD 造模方法，結果表明，腹腔注射LPS 損傷了小鼠在Y 迷宮中的學習記憶力，同時IL-1β 水平的升高和星形膠質細胞的激活也意味著神經炎癥的發生［17-19］。AD 患者的臨床常用藥多奈哌齊作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，在改善AD 樣癥狀的同時可以干預AD 模型中炎癥的表達，但是其具體的抗炎作用機制尚未明了［20］。Aβ 是一種關鍵的AD 病理毒性蛋白，神經炎癥的過度激活可以促進Aβ 的生成，可能是加劇Aβ 毒性的重要途徑［21-23］。腹腔注射LPS后，小鼠海馬內Aβ 的沉積水平升高，這是誘導小鼠學習記憶力損傷的重要原因［24-25］； 高劑量組萱草花給藥后，小鼠的Aβ 沉積水平伴隨著記憶力的改善得到了回調，這表明萱草花確實具有潛在的抗AD 活性，與改善神經炎癥相關，具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學預測了萱草花抗AD的作用機制，并進一步通過體內實驗驗證它可改善LPS 誘導的AD 模型鼠在Y 迷宮中的學習記憶力和病理損傷，抑制IL-1β 水平，調控星形膠質細胞的激活，為相關治療提供了實驗依據。