基于網絡藥理學和細胞實驗探討雷公藤紅素抗鼻咽癌的作用機制

王 婷，張 黎，儲永雙，王迎秋，任艷鑫，黃 寧*

（1.昆明醫科大學基礎醫學院，云南 昆明 650000； 2.昆明市第三人民醫院醫務部，云南 昆明 65000；3.昆明醫科大學第三附屬醫院頭頸外一科，云南 昆明 650000）

鼻咽癌為鼻咽上皮腫瘤［1-2］，2015 年我國有6 萬例，其中3.4 萬例死亡［3］，其治療以放療為主［4］，但初步治療5% ～20%患者出現復發［5-6］； 到晚期以放化療聯合為主，可改善患者的生存情況，但引起的不良反應使其生存質量下降［7］，故需開發抗腫瘤同時提高生存質量的藥物。

植物活性成分具有益處多和副作用小一直被用作藥物有效替代［8］。研究表明，雷公藤紅素通過抑制自噬和NFκB 的異常激活作用骨關節炎［9］，對MSCLC 的影響是因蛋白酶體活性的抑制［10］，降低microRNA-21 抑制胃癌細胞生長轉移［11］，誘導耐藥細胞凋亡通過ERK1/2 和p38 MAPK［12］，通過死亡受體和線粒體途徑激活誘導鼻咽癌細胞凋亡［13］。雷公藤紅素作用靶點多，機制復雜，故需進一步研究以確定它與鼻咽癌之間其他相互作用的靶點，闡明其機制。

網絡藥理學是將藥物靶點與特定節點或模塊間的交互作用結合起來的一種藥理學方法，來闡明藥物和靶點之間的聯系［14］。本研究利用網絡藥理學和分子對接驗證雷公藤紅素的作用靶點、信號通路對鼻咽癌機制影響，再通過CNE-1 細胞從實驗來評價雷公藤紅素藥理作用，以期為后續研究提供依據。

1 材料

1.1 細胞株 人鼻咽癌細胞CNE-1 （低分化） 購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.2 藥物 雷公藤紅素購自成都樂美天醫藥科技有限公司，編號DL0035。

1.3 試劑與儀器 RPMI1640 培養基（批號B1106022）、胎牛血清（批號BS1612-109）（美國Bioexplorer 公司）； 青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號BL505A）、PBS 緩沖液（批號1401130）（合肥蘭杰柯科技有限公司）； AnnexinV 633Apoptosis Detection Kit（日本同仁化學公司，批號0600452）； DMSO （美國Sigma 公司，批號506008）； 兔抗IKBKB、NF-κB P65、Phospho-NF-κB P65、抗兔二抗（美國Affinity 公司，批號DF6811、AF5006、AF2006、AF7018）。電泳儀、電泳槽、轉印槽（北京普天新橋技術有限公司）； BD FACSCelesta3激光流式細胞儀（美國BD Biosciences 公司）。

2 方法

2.1 鼻咽癌靶點篩選 通過PubChem 數據庫（http： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 搜索關鍵詞 “celastrol”，得到其3D 結構，導入Swisstarget 平臺 （http： //www.swisstar-getprediction.ch/），得到相關預測靶點。再通過GeneCards 數據庫（http： //www.genecards.org/） 搜索關鍵詞“鼻咽癌”，得到其相關靶點。通過微生信云平臺（http： //www.bioinformatics.com.cn/） 繪制鼻咽癌與Celastrol 的靶點交集圖。

2.2 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI） 網絡可視化構建及分析 將微生信云平臺得到韋恩圖中的雷公藤紅素-鼻咽癌交集基因輸入至STRING 數據庫（https： //string-db.org/），獲取PPI 網絡圖。

2.3 靶點生物功能注釋及通路分析 在Metascape 數據庫（https： //metascape.org/） 中輸入交集靶點進行基因本體（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 通路富集分析，得到相關靶點功能和通路。

2.4 “雷公藤紅素-靶點-鼻咽癌-通路” 網絡圖構建 收集雷公藤紅素抗鼻咽癌的交集靶點和KEGG 通路富集分析結果，導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“雷公藤紅素-靶點-鼻咽癌-通路” 關系網絡圖，獲得度值前五的基因。

2.5 分子對接 采用Discovery studio 分子對接軟件建立藥物分子與靶點的相關性。通過RCSB： PDB 蛋白質數據庫得到對應蛋白質結構，導入Discovery Studio 中，初步預處理后通過加氫除水和結構簡化優化結構，同時將雷公藤紅素分子式和陽性藥物5-氟尿嘧啶分子式從PunChem 數據庫下載，再導入軟件構建分子結構，對接后獲得LibDockScore，生成配體-蛋白相互作用3D 和2D 平面圖。

2.6 MTT 法檢測雷公藤紅素對CNE-1 細胞的增殖抑制作用 消化離心收集細胞，以每孔2.0×105的密度接種于96孔板上，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中過夜。第2 天加入含雷公藤紅素的培養基100 μL，濃度分別為0、2、4、6 μmol/L，培養24 h，每組設置3 個復孔，每孔加入25 μL MTT，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光慢搖10 min，在570 nm 波長處檢測光密度，計算細胞抑制率。

2.7 流式細胞術檢測雷公藤紅素對鼻咽癌細胞的促凋亡作用 按“2.6” 項下方法處理細胞，用無EDTA 的0.25%胰蛋白酶溶液洗滌，收集細胞，加入染色液，避光常溫染色15 min，按照相關試劑盒說明書操作檢測細胞凋亡率。

2.8 Western blot 法檢測IKBKB、Phospho-NF-κB P65 蛋白表達 將CNE-1 細胞密度調整為5.0×105/mL，接種于6 孔板中，每孔1.5 mL，培養過夜，分別加入0、4 μmol/L 雷公藤紅素繼續培養24 h，收集細胞，PBS 清洗3 次，裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min 離心5 min，檢測總蛋白濃度，變性，-80 ℃保存。SDS-PAGE 電泳80 V，30 min； 120 V，60 min； 100 V，150 min，封閉液37 ℃，30 min，TBST 洗膜3 次，加入一抗，室溫孵育30 min，4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗3 次，室溫二抗孵育2 h，TBST 洗膜3 次，條帶短暫保存在4 ℃新鮮TBST 中。采用ChemiDocTMMP 全能型成像系統顯影，以β-actin 為內參，Image J 軟件計算蛋白表達。

2.9 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學研究

3.1.1 雷公藤紅素潛在靶點預測 3D 結構見圖1，將其導入SwissTarget 平臺中獲得雷公藤紅素靶點，通過Probability排序，獲得前10 個基因名稱和靶點，見表1。

表1 雷公藤紅素排名前十的潛在作用靶點

圖1 雷公藤紅素3D 結構

3.1.2 雷公藤紅素與鼻咽癌相關的共同靶點 從GeneCards 數據庫中獲得與鼻咽癌相關的基因靶點2 143個，將101 個藥物靶點基因與其篩選出共同交集靶點基因38個，即為雷公藤紅素抗鼻咽癌的潛在靶點基因，見圖2。

圖2 雷公藤紅素抗鼻咽癌潛在靶點

3.1.3 雷公藤紅素與鼻咽癌相關靶點的PPI 網絡 將38個交集靶點導入STRING 數據庫，PPI 網絡圖見圖3。

圖3 雷公藤紅素抗鼻咽癌PPI 網絡圖

3.1.4 GO 富集分析 得到生物過程（biological process，BP） 442 條、細胞組成（cellular component，CC） 18 條、分子功能（molecular function，MF） 35 條，將排名前十的三者利用微生信在線平臺繪制成氣泡圖，見圖4。由此可知，BP 主要包括細胞對炎癥反應的調節、對激素的反應、防御反應的調節、血管生成的調節、血管發育的調節等通路，CC 主要包括粘著斑、細胞-基質連接、受體復合物、膜筏、膜微區細胞組成部分等通路，MF 主要包括內肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、肽酶活性、絲氨酸型內肽酶活性等途徑。

圖4 GO 功能富集分析

3.1.5 KEGG 通路富集分析 共得到77 條通路，根據P值排序，發現前15 條通路包括腫瘤、新冠肺炎、PI3KAkt、脂質與動脈粥樣硬化、人T 細胞白血病病毒1 型感染等，氣泡圖見圖5。由此可知，在腫瘤、PI3K-Akt 等通路上富集較多。

圖5 KEGG 通路富集分析

3.1.6 “雷公藤紅素-靶點-鼻咽癌-通路” 網絡模型 見圖6，左側38 個綠色節點代表雷公藤紅素抗鼻咽癌交集的靶點，根據節點度值按順時針從大到小依次排列； 右側15個藍色節點則對應了KEGG 富集結果中的15 條通路，連線顯示了通路和靶點之間的相互作用，度值前五的基因為JAK1、IKBKB、IL6、PLCG1、JAK2。

圖6 “雷公藤紅素-靶點-鼻咽癌-通路” 網絡圖

3.1.7 分子對接 將“3.1.6” 項下排名前五的基因與雷公藤紅素分別進行結合能力預測，同時以5-氟尿嘧啶作為陽性對照。結果顯示，雷公藤紅素與IKBKB和JAK2 有較好結合活性，LibDockScore 越高，結合越穩定。雷公藤紅素與IKBKB的 LibDockScore 為94.266 3，與JAK2 的LibDockScore 為67.294 6，而5-氟尿嘧啶與IKBKB的LibDockScore 為63.204 8。以3D 作用圖和2D 相互作用圖進行驗證，見圖7，可知雷公藤紅素中的羥基與IKBKB中的CYS99 形成氫鍵，雷公藤紅素中的羰基與JAK2 中的HIS950 形成氫鍵，5-氟尿嘧啶中的嘧啶環3 號氮和6 號羥基分別與IKBKB 中的SER436 和ARG404 形成氫鍵。因雷公藤紅素與IKBKB的LibDockScore 值遠大于雷公藤紅素與JAK2 的，故后續分子實驗圍繞IKBKB進行。

圖7 “活性成分-作用靶點” 分子對接圖

3.2 細胞實驗

3.2.1 雷公藤紅素對CNE1 細胞增殖的影響 與對照組比較，雷公藤紅素各劑量組細胞存活率降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖8。

圖8 雷公藤紅素對CNE1 細胞增殖的影響（±s，n＝6）

3.2.2 雷公藤紅素對CNE1 細胞凋亡的影響 與對照組比較，雷公藤紅素各劑量組細胞凋亡率升高（P＜0.01），并呈劑量依賴性，見圖9。

圖9 雷公藤紅素對CNE1 細胞凋亡的影響（±s，n＝6）

3.2.3 雷公藤紅素對 CNE-1 細胞 IKBKB、Phospho-NF-κB P65蛋白表達的影響 與對照組比較，雷公藤紅素4 μmol/L組細胞IKBKB、Phospho-NF-κB P65 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖10。

圖10 雷公藤紅素對CNE-1 細胞IKBKB、Phospho-NF-κB P65 蛋白表達的影響（±s，n＝6）

4 討論

鼻咽癌是一種鼻咽上皮里的惡性腫瘤。根據鼻咽癌發生的范圍和位置，患者可能會出現鼻塞、鼻出血、伴有聽力損傷的中耳炎、頸部腫塊或其他神經癥狀，比如頭痛和面部麻木［15］。鼻咽癌患者在放療時會誘發口干癥［16］。還會導致口腔潰瘍發炎、嘴唇活動受阻、飲食困難、甚至腦脊髓并發癥等一系列不良反應［17］。

中醫藥目前已獲得廣泛的抗腫瘤臨床應用，在延長患者的生命、提高其生活質量等方面的作用得到了更多的肯定［18］。Chan 等［19］研究表明，雷公藤紅素通過抑制CXCR4相關信號和抑制體內腫瘤生長對肝細胞癌的潛在抗癌作用。Lin 等［20］研究表明，雷公藤紅素促進口腔癌細胞凋亡，其機制是誘導JNK1/2 信號通路。

本研究分析了雷公藤紅素“藥物-靶點-疾病-通路” 網絡模型，結果顯示JAK1、IKBKB、IL6、PLCG1、JAK2 等度值較高，是雷公藤紅素治療鼻咽癌的關鍵潛在靶點基因。再結合分子對接分析，結果顯示雷公藤紅素與IKBKB和JAK2 有較好結合活性，故推測IKBKB為雷公藤紅素作用于鼻咽癌的主要靶點基因。IKBKB （又名為IKKβ） 是IKK 復合體中一個重要的催化亞基，IKBKB 與催化亞基IKKα 以及調節亞基IKKγ 結合而形成IKK 復合物。在組成IKK 復合物的催化亞基中，NF-κB 的激活IKBKB 起到不可或缺的作用［21］。故NF-κB 信號通路是雷公藤紅素作用于鼻咽癌的關鍵通路。李媛媛等［22］研究發現，肺腺癌細胞中敲除IKKβ 可以降低NF-κB 引起的炎癥反應。Zhou 等［23］研究發現，miR-429 在神經母細胞瘤細胞系中表達下調，其可以誘導這些細胞系的細胞凋亡并抑制其增殖。miR-429 可與IKKβmRNA 的3′-UTR 結合，過度表達IKKβ 可逆轉細胞增殖，阻斷miR-429 的作用，說明miR-429 作為腫瘤抑制因子的機制為與IKKβ 相互作用，IKKβ 是激活NF-κB 核轉運的IKK 復合物的催化亞單位。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學及分子對接進行預測，而后通過細胞實驗和分子實驗等對雷公藤紅素抗鼻咽癌的機制進行了多維度深層次的研究，為未來鼻咽癌相關實驗及臨床治療提供了重要的參考依據。