淺談熒光檢測分析儀器中的光學濾光片

關鍵詞：熒光；光學濾光片；檢測分析儀器；光學薄膜

中圖分類號：O 436；TB 43 文獻標志碼：A

引言

熒光檢測技術是20世紀七八十年代逐漸成熟起來的一種新型檢測技術[1-2]，其優勢在于靈敏度高，抗干擾能力強。隨著該技術的不斷完善，它被廣泛應用于生物醫學、食品安全、水質檢測、藥物學以及材料學等領域中[3-10]。典型的熒光檢測分析儀器包括熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、熒光顯微鏡、基因測序儀、流式細胞儀等。

在眾多熒光檢測分析儀器內部，往往需要使用一組或多組光學濾光片（以下簡稱“濾光片”），用于提取熒光信號和濾除光路系統中的干擾光。濾光片性能的高低直接決定著儀器的檢測精度和可靠性，是儀器中的核心光學元件。隨著檢測分析儀器逐漸向著檢測速度更快，檢測精度更高，檢測性能更穩定，結構更加精巧的方向發展，人們對濾光片的性能要求還在不斷提升。本文將從濾光片的工作原理、設計理念、設計技術、制備技術以及發展新趨勢等方面，分析論述熒光檢測分析儀器中的濾光片。

1濾光片的工作原理

熒光檢測分析儀器是基于熒光發光原理設計的。所謂“熒光”，是物質的電子吸收激發光能量躍遷至激發態，在其返回基態過程中發射出的光。熒光物質發射的熒光波長通常大于其激發光譜的波長（如圖1所示），其波長差值稱為“斯托克斯位移”[11]。根據這種“斯托克斯位移”現象，再利用光學濾光片的濾光、分光等光譜特性，能夠將激發光與熒光分離出來，進而對獲得的熒光信號進行后續處理。

對應1種熒光試劑，通常以“激發濾光片”、“發射濾光片”和“分色鏡”的組合來完成儀器所需的光學功能，它們稱為1個“濾光片組”。其在儀器內部的典型工作過程如圖2所示：光源發出的寬譜段混合光，通過“激發濾光片”后形成準單色激發光；該激發光被“分色鏡”反射后入射到樣本上，激發樣本中的熒光試劑發出熒光；熒光經“分色鏡”透射后到達“發射濾光片”，同時到達的還有少量激發光和環境雜散光等；“發射濾光片”濾除各種干擾光因素，使最終所需的熒光信號進入光電接收系統。

2濾光片的設計理念

2.1與熒光試劑匹配

應用于熒光檢測分析儀器中的濾光片，在設計時必須考慮其光譜特性與所使用熒光試劑的對應關系。

激發濾光片的作用是選擇透射特定波段的激發光。在熒光試劑的激發光譜中，譜線所涵蓋的光譜波段都能夠激發出熒光，并且越靠近譜線峰值的光，其熒光激發效率越高，因此激發濾光片在設計時應盡量包含激發光譜峰值附近的波段。考慮到激發濾光片與發射濾光片的光譜不能重疊，激發濾光片的光譜類型可以分為如圖3所示的“短波通型”和“帶通型”。

發射濾光片的作用是選擇透射特定波段的熒光發射光。在熒光試劑的發射光譜中，譜線所涵蓋的光譜波段都是可用的熒光波段，并且越靠近譜線峰值的光，受激發射的熒光能量越強，因此發射濾光片在設計時應盡量包含熒光發射光譜峰值附近的波段。考慮到發射濾光片與激發濾光片的光譜不能重疊，發射濾光片的光譜類型可以分為如圖4所示的“長波通型”和“帶通型”。

很多熒光檢測分析儀器不限于一個檢測通道，以熒光PCR儀為例，4～6個檢測通道已成為該類儀器的主流。在多通道熒光檢測分析儀器中，被測樣本中同時包含多種熒光試劑（每個檢測通道對應一種熒光試劑），為降低通道之間的信號干擾，激發濾光片和發射濾光片均以“帶通型”更為常見。

分色鏡的作用是利用透射和反射將激發光和熒光的傳播方向分離開，通常傾斜45°使用。根據不同的光路系統設計，分色鏡的光譜類型可以是反射激發光、透射熒光的“長波通型”，或者透射激發光、反射熒光的“短波通型”（如圖5所示），最常見的是“長波通型”。

2.2熒光與激發光相互隔離

熒光試劑受激發射的熒光非常微弱，其能量僅相當于激發光的10?3～10?4[12-14]。為了有效檢測到熒光信號，必須保證熒光與激發光之間相互隔離。因此，激發濾光片與發射濾光片之間要求有足夠的截止深度。

描述濾光片截止區域對光的截止程度，經常使用光密度（optical density，OD）參數，其值D是對濾光片的透射率取常用對數值[15]

D（λ）=-lg[T（λ）] （1）

式中，T（λ）表示在λ波長位置時濾光片的透射率。

為了獲得基本的熒光信號，激發濾光片與發射濾光片在整個工作波段（通常為200～1100nm）的隔離程度應在OD4以上。為了保障檢測儀器的測試精度和準確性，大多數熒光檢測儀器要求激發濾光片和發射濾光片的這種隔離程度應達到OD5～OD6，特別是要確保激發濾光片在發射濾光片的透射區波段具有OD6以上的截止深度，相應的，發射濾光片在激發濾光片的透射區波段也應具有OD6以上的截止深度（如圖6所示）。

3濾光片的設計和制造

3.1設計技術

濾光片的光譜特性是基于光學薄膜技術來設計的。所謂光學薄膜技術，是指利用光學干涉原理，優化設計光學薄膜系統，進而實現對光學元件基底表面光譜特性精準調控的技術。如圖7所示，光學元件基底表面鍍有多層納米級光學薄膜，每一層薄膜的膜厚均經過精準設計。入射光在每個膜層表面發生多次的反射和透射，這些光彼此之間產生了干涉效應，最終使光學元件實現既定的濾光或分色等光學效果[16-18]。

在設計熒光檢測分析儀器用濾光片時，首先堆疊足夠的膜堆，使濾光片截止區域的寬度和深度滿足技術指標要求并留有一定的余量，然后綜合采用單純形法、共軛梯度法、針式法等多種優化方法，降低濾光片透射區域的波紋。在優化過程中，濾光片截止區域的寬度和深度都會變差，因此初始膜系在截止寬度和深度方面所留的余量要足夠，如有必要，可對某些關鍵區域的背景（如激發濾光片與發射濾光片彼此相鄰的區域）鎖定后再進行優化。增加初始膜系的層數，有利于提高濾光片的性能，但制造難度和制造成本也會顯著提升，因此優秀的濾光片設計，往往追求降低設計冗余，即采用盡可能少的光學膜層來達到所需的光譜特性要求。

3.2制造技術

濾光片的制造通常采用物理氣相沉積（physical vapor deposition，PVD）方法，即在真空技術條件下，采用物理方法將薄膜材料表面氣化為原子或分子，或者部分電離成離子，通過低壓氣體過程在基底表面沉積為薄膜。制造熒光檢測分析儀器用濾光片，行業上普遍采用以下3類鍍膜設備，結合各設備的特點加以介紹。

（1）蒸發鍍膜設備。其優點是：膜層沉積速率高，單次鍍膜產量大，成本低。其主要缺點是：最大鍍膜層數較少（100層左右），膜厚控制精度較低（控制誤差為0.5%左右）。要實現彼此隔離達到OD6的激發濾光片和發射濾光片，每個濾光片都需要鍍制4～5個子片，膠合在一起才能實現。

（2）磁控濺射設備。與蒸發鍍膜設備相比，該類設備成膜的膜層均勻性好，膜厚控制精度較高（控制誤差為0.2%左右），最大鍍膜層數較多（200層左右）。而相對的缺點是：單次鍍膜產量較少，鍍膜成本較高。采用該設備制造彼此隔離達到OD6的激發濾光片和發射濾光片，可考慮使用在一個基底的兩個表面分別鍍膜的方案。

（3）離子束濺射設備。該類設備成膜的均勻性更好，膜厚控制精度更高（控制誤差為0.1%左右），鍍膜層數可超過500層。而相對缺點是：膜層沉積速率低，單次鍍膜產量更小，鍍膜成本更高。采用該設備制造彼此隔離達到OD6的激發濾光片和發射濾光片，在一個基底上單面鍍膜就可實現。

采用磁控濺射設備或離子束濺射設備制造濾光片，由于單次鍍膜的層數較多，必須選擇表面光潔度高的優質基底，否則可能出現濾光片表面發霧等現象，影響其光學性能；另一方面，必須開發更好的膜層監控工藝方案，充分降低膜厚誤差，否則可能出現實際鍍制的濾光片光譜與設計光譜相差甚遠的現象。總之，以上3類鍍膜設備各有特點，在實際應用中應結合濾光片的光譜特性要求，綜合考慮制造難度和制造成本，選擇適合的鍍膜設備和工藝實現方案。

4濾光片的發展趨勢

隨著熒光檢測分析儀器的不斷發展，濾光片正在經歷著一些變化。總的來說，濾光片的發展趨勢包括以下幾個方面。

4.1單片集成化

傳統的濾光片為多片膠合結構，即通過多個子片共同實現一種所需的光譜特性，如圖8（a）所示，每個子片均采用蒸發鍍膜設備生產。而隨著即時檢驗（point-of-caretesting，POCT）等小型化設備的出現和普及，人們對單片集成化鍍膜的需求激增，即僅使用1片基底來實現所需的光譜特性，見圖8（b）。實現單片集成化鍍膜，要求每次鍍膜層數更多，膜厚控制更加精準，往往需要使用磁控濺射設備或離子束濺射設備來實現。

對于濾光片的單片集成化鍍膜，歐美等國家具有明顯的優勢，在膜系設計方法、工藝控制手段和鍍膜設備性能等方面都代表著國際領先水平[19-20]，已經形成了成熟的標準產品和相當的產業規模。國內目前在該領域處于快速發展期，近5年來，國內一些優秀的鍍膜企業逐步推出了自己的單片集成化鍍膜產品，從一定程度上實現了進口替代，但生產這些濾光片的鍍膜設備仍以德國和美國的進口設備為主。

4.2光譜復雜化

為了優化光路，降低成本，滿足設備微型化、集成化的應用需求，越來越多的熒光檢測分析儀器采用雙通帶或多通帶濾光片，即在1片濾光片中含有兩個或多個光譜通帶區域。與之相對應，分色鏡也不再是簡單的“長波通型”或“短波通型”，而是更趨向于一種綜合類型。圖9給出了一種典型的雙通帶濾光片組光譜示意圖。

多通帶激發濾光片和發射濾光片，其設計難點在于同時滿足多個通帶的位置、帶寬以及所需的截止深度要求。多通帶分色鏡的設計難點在于，光線45°傾斜入射時，在多個透射帶和反射帶之間實現高陡度消偏振效果。不同廠商對這些濾光片的設計方法不盡相同，相關報道包括“一維晶體缺陷層模型”、“雙對稱結構”、“循環嵌套模型”等[21-25]。

目前，國內在雙通帶濾光片和分色鏡的設計和制造方面進步較快，部分國產產品的光學性能與國際先進水平相差無幾，然而對于3通帶以上的濾光片和分色鏡產品，國內還鮮有廠商穩定量產，而美國的Semrock、Chroma等公司，其標準產品中就包含多種5通帶濾光片及配套分色鏡。因此，國內光學薄膜行業在復雜光譜的設計和制造方面還有很大的進步空間。

4.3低波前畸變

有些熒光檢測分析儀器對成像品質有高質量需求（如基因測序儀），有些熒光檢測分析儀器需要對多個激發光源進行精準合束（如流式細胞儀），此時往往要求濾光片能夠對波前畸變進行有效抑制。

波前畸變包含“透射波前畸變”和“反射波前畸變”兩類，是指入射光經濾光片作用后，其透射光或反射光的波前（波面）相對于理想波前（波面）的改變程度，如圖10所示。波前畸變通常用“xλ@檢測波長”的形式表示，其中“檢測波長”通常取632.8nm，而“x”為具體的數值，其值越小代表波前畸變程度越低。

影響濾光片波前畸變的主要因素有兩個：

（1）基底質量。當基底的材質均勻，表面光潔度高，表面形變量小時，采用該基底制備濾光片才具備擁有低波前畸變的可能，特別是濾光片的“透射波前畸變”特性幾乎完全由基底質量決定。我國當前量產化的光學玻璃基底，波前畸變能夠達到優于0.25λ@632.8nm的行業水平，而國際先進水平可以優于0.1λ@632.8nm。

（2）膜層應力。鍍制在基底上的膜層會產生“張應力”或“壓應力”效果，進而拉彎基底的表面形狀（如圖11所示），嚴重影響濾光片的“反射波前畸變”特性。針對這一現象，光學薄膜制造企業往往通過“優化膜料選擇和膜系設計”、“雙面應力匹配鍍膜”、“鍍膜后退火處理”等手段進行改善。通過多手段結合，膜層應力的影響效果會顯著降低。

我國當前商業化的低波前畸變濾光片的透射波前畸變可優于0.25λ@632.8nm，反射波前畸變可達到（0.25～0.50）λ@632.8nm的水平，滿足大多數中高端儀器的應用需求。應用于更高端儀器的濾光片往往要求透射和反射波前畸變優于0.1λ@632.8nm。目前僅美國等少數國家具有相對成熟的制備工藝，一個濾光片的價格可高達上千美元，仍處于行業壟斷狀態。

4.4更深更銳截止

為了進一步提升熒光檢測分析儀器的性能，人們期望借助濾光片使儀器的光學系統獲得更優異的信噪比，這推動著濾光片的截止背景向著更深更銳的方向發展。

（1）更深截止。提高濾光片的截止深度，能夠使熒光與激發光之間實現更有效的隔離，便于更好地提取熒光信號、抑制干擾光，從而使信噪比得到提升。對于某些使用高功率激光器作為激發光源的儀器而言，濾光片OD6的截止深度已經不能完全滿足應用需求，往往需要將截止深度提升到OD7或OD8以上。

（2）更銳截止。濾光片的光譜從透射區向截止區變化得更快——即濾光片的截止陡度更高時，在保障熒光和激發光有效隔離的前提下，能夠讓濾光片的帶寬做得更寬，從而獲得更高的激發能量和更強的熒光信號，進而獲得更好的信噪比。對于某些使用小斯托克斯位移型熒光試劑的儀器而言，提高濾光片的截止陡度是改善系統信噪比非常重要的手段。

提升濾光片截止背景的深度或陡度，除了使產品制造難度增加以外，在產品的性能檢測方面也提出了更高要求。目前，我國光學薄膜行業對濾光片截止深度檢測的普遍精度在OD6～OD7的水平，對截止陡度的檢測分辨率為3～4nm；而國際先進水平，截止深度可準確測量到OD9以上，截止陡度的檢測分辨率可達1nm以內。因此，我國光學薄膜行業今后在研究提高濾光片設計制造水平的同時，也應同步提升產品檢測水平。

5結束語

在濾光片的設計和制造等方面，歐美等發達國家具有先發優勢。但令人欣慰的是，隨著我國科技水平的不斷進步，國產濾光片的各項性能已呈現出顯著提升的態勢，濾光片的國產化替代進程已全面開啟。國內部分廠家采用國產濾光片制造的“實時定量PCR儀”和“基因測序儀”等熒光檢測分析儀器，其性能具備了比肩國際一流企業產品的能力。相信隨著國產濾光片設計制造等各項水平的不斷提升，今后將有更多優秀的國產熒光檢測分析儀器脫穎而出。