LncRNA MEG3靶向調節miR-17-5p對缺氧缺血性腦損傷新生小鼠血-腦屏障的影響

范敏娜,李明

新生兒缺血缺氧性腦病(HIE)是圍產期因窒息導致的腦缺血缺氧引發腦組織受損的疾病,嚴重威脅生命,且存活者遺留后遺癥[1-2]。血-腦屏障是血液與腦組織間的屏障,可阻礙有害物質自血液流向大腦損傷腦組織,缺血缺氧的強刺激可改變血-腦屏障通透性致其受損,引起繼發性神經元損傷[3-4]。血-腦屏障受損是HIE發病及導致不良預后的重要機制,因此改善血-腦屏障損傷、控制腦水腫對HIE的治療有幫助。LncRNA MEG3是缺血缺氧性腦損傷(HIBD)的靶點[5],可調節內皮細胞功能與血管生長[6]。miR-17-5p在抑制HIBD新生大鼠炎性激活中發揮作用[7],且與miR-17-5p存在靶向關系[8]。本研究通過構建HIBD新生小鼠模擬HIE,探究LncRNA MEG3調控miR-17-5p對HIBD新生小鼠血-腦屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7日齡C57BL小鼠(SPF級)90只,購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(粵)2022-0063],雌雄各半,質量4.5～4.8 g,由體格健壯的母鼠喂養。

1.1.2 主要試劑 si-NC、si-LncRNA MEG3、anti-miR-NC、anti-miR-17-5p購自上海生工;EB(R20616)購自上海源葉生物科技有限公司;總RNA抽提試劑盒(12183016)、逆轉錄試劑盒(4366597)、總蛋白提取試劑盒(89842)購自賽默飛世爾科技公司;ZO-1(ab190085)、Occludin(ab216327)、GAPDH(ab9485)兔抗以及HPR標記的羊抗兔(ab6721)購自美國abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及干預方法 按照隨機數字表法將小鼠分為對照組、模型組、si-NC組、si-LncRNA MEG3組、si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組、si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組,每組15只。除對照組外,其余各組小鼠均按照文獻[9]方法構建HIBD模型。乙醚吸入麻醉后讓小鼠仰臥于手術板上,碘伏局部消毒后在頸部正中切口,分離皮下組織,結扎右側頸總動脈,逐層縫合皮膚,送回母籠恢復。2 h后將其放入包含8%氧氣+92%氮氣混合氣體的密閉缺氧箱中缺氧處理2 h,完成造模。造模結束使用Longa評分進行神經行為缺損評分,評分為2～3分即為造模成功[10]。造模成功后,si-NC組、si-LncRNA MEG3組分別腦內注射5 μL si-NC及si-LncRNA MEG3,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組、si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組除注射si-LncRNA MEG3外注射5 μL anti-miR-NC與anti-miR-17-5p,注射完畢退針。

1.2.2 神經功能評分 各組小鼠處理完畢后均進行Longa評分。0分:無神經功能損傷;1分:小鼠不能完全的伸直前肢;2分:小鼠一側癱瘓,存在追尾現象;3分:小鼠不能打滾及站立;4分:小鼠無法進行自發性活動,存在意識障礙。

1.2.3 血-腦屏障通透性測定 各組小鼠造模后按照1.2.1的分組方法處理24 h,然后每組挑選5只小鼠通過尾靜脈注射2% EB(2 mL/kg),循環1 h后,生理鹽水灌流,斷頭取缺血側腦組織,于冰上分離,稱量濕重,加入5 mL甲酰胺,對腦組織進行勻漿,水浴48 h,離心(4000 r/min、15 min)。分光光度計測定上清液吸光度值(630 nm處),計算腦組織中EB含量,設置3個重復。EB含量與血-腦屏障通透性呈正比。

1.2.4 腦含水量情況測定 各組小鼠造模后按照1.2.1的分組方法處理24 h,然后每組挑選5只小鼠,采用戊巴比妥鈉麻醉后斷頭取左側腦組織,稱量濕重,烘干后測干重。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5 LncRNA MEG3、miR-17-5p水平測定 每組選取剩余的5只小鼠分離血腫組織,平均分為3份。提取其中一份腦組織RNA,將一定量的RNA逆轉錄為cDNA,通過實時熒光定量PCR法進行擴增,程序設定為:95 ℃預熱5 s,95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s,以2-△△Ct方法分析LncRNA MEG3、miR-17-5p表達情況,其中LncRNA MEG3以GAPDH作為內參,miR-17-5p以U6作為內參,引物見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.2.6 小鼠血-腦屏障結構觀察 取1.2.5中腦組織一份,經過固定(1%鋨酸)、脫水、包埋后切片(60 nm),進行醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察腦組織切片超微結構。

1.2.7 小鼠腦組織ZO-1、Occludin蛋白測定 取1.2.5中腦組織一份并裂解,離心后得上清,總蛋白經蛋白提取試劑盒提取,定量蛋白(BCA試劑盒),經SDS-PAGE電泳后將目的蛋白轉膜至PVDF膜,封閉,添加ZO-1、Occludin、GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1000),孵育過夜后添加二抗,孵育1 h,ECL試劑進行顯色后經凝膠成像儀曝光、觀察,Image-J軟件分析ZO-1、Occludin蛋白灰度值,并計算其含量。

2 結 果

2.1 各組小鼠神經功能缺損評分的比較 與對照組(0分)相比,模型組[(2.60±0.32)分]小鼠神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,si-NC組[(2.57±0.28)分]小鼠神經功能缺損評分差異無統計學意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3組[(1.40±0.15)分]小鼠神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組[(1.42±0.17)分]小鼠神經功能缺損評分差異無統計學意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組[(1.94±0.21)分]小鼠神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)。

2.2 各組小鼠腦含水量的比較 與對照組[(62.10±2.15)%]相比,模型組[(85.23±2.25)%]小鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,si-NC組[(83.57±2.26)%]小鼠腦含水量差異無統計學意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3組[(72.79±2.04)%]小鼠腦含水量顯著降低(P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組[(73.75±2.06)%]小鼠腦含水量差異無統計學意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組[(78.58±2.19)%]小鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)。

2.3 各組小鼠血-腦屏障血管內皮細胞情況 見圖1。對照組小鼠血管內皮結構完整、薄厚均勻、無明顯水腫、內皮細胞連接緊密,吞飲小泡數量少。模型組小鼠血管內皮薄厚不均多處呈現水腫狀態、內皮細胞連續性消失、吞飲小泡數量增多。與模型組相比,si-LncRNA MEG3組血管內皮細胞逐漸連接緊密、薄厚較為均勻,水腫減少;與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組血管內皮細胞損傷加重。

圖1 各組小鼠血-腦屏障血管內皮細胞電鏡圖(×15000)

2.4 各組小鼠血-腦屏障通透性比較 與對照組[(8.72±1.06)μg/g]相比,模型組[(31.75±4.69)μg/g]小鼠EB含量升高(P<0.05)。與模型組相比,si-NC組[(32.16±4.52)μg/g]小鼠EB含量差異無統計學意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3組[(14.35±2.71)μg/g]小鼠EB含量降低(P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組[(14.62±2.69)μg/g]小鼠EB含量差異無統計學意義(P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組[(21.37±3.58)μg/g]EB含量升高(P<0.05)。

2.5 各組小鼠miR-17-5p、LncRNA MEG3表達情況的比較 見表2。與對照組相比,模型組小鼠LncRNA MEG3水平顯著升高,miR-17-5p顯著降低(均P<0.05)。與模型組相比,si-NC組小鼠LncRNA MEG3、miR-17-5p水平差異無統計學意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3組小鼠LncRNA MEG3水平顯著降低,miR-17-5p水平顯著升高(均P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組小鼠LncRNA MEG3、miR-17-5p水平差異無統計學意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組miR-17-5p水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠LncRNA MEG3、miR-17-5p水平的比較(n=5)

2.6 各組小鼠ZO-1、Occludin蛋白水平的比較 見圖2、表3。與對照組相比,模型組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。與模型組相比,si-NC組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達差異無統計學意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。與si-LncRNA MEG3組相比,si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達差異無統計學意義(均P>0.05),si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組ZO-1、Occludin蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。

圖2 各組小鼠ZO-1、Occludin蛋白表達A:對照組;B:模型組;C:si-NC組;D:si-LncRNA MEG3組;E:si-LncRNA MEG3+anti-miR-NC組;F:si-LncRNA MEG3+anti-miR-17-5p組。

表3 各組小鼠腦組織ZO-1、Occludin蛋白水平的比較(n=5)

3 討 論

新生兒HIE是圍生期窒息引發的腦部缺血缺氧導致腦組織受損的疾病,對患兒的生存以及日后生活質量均有負面影響[11]。血-腦屏障是遍布于腦組織周圍的腦毛細血管壁構成的脈絡叢屏障,可以有效隔開血漿與CSF,阻礙血液中的一些有害物質進入,在維護CNS的生理功能方面發揮重要作用[12]。缺血缺氧造成的刺激會引起血-腦屏障結構的損害,為繼發性腦損傷提供條件。

本研究通過構建新生小鼠HIBD模型進行血-腦屏障影響相關機制的研究,所構建模型腦組織含水量升高,出現神經受損癥狀,提示新生小鼠造模成功,有神經受損、氧化應激損傷癥狀。LncRNA在大腦中特異性表達,并參與神經系統疾病。大量研究[13-14]顯示,LncRNA在HIBD模型中表達異常。LncRNAMEG3是一種抑癌基因,在腦損傷相關疾病中發揮一定作用。LncRNA MEG3在神經系統疾病中異常表達,如MEG3-miR-455-pI3K軸在大腦中動脈閉塞小鼠腦梗死缺氧神經干細胞損傷模型的氧化應激、增殖、凋亡中發揮作用[15];下調MEG3可減少中腦動脈閉塞/再灌注模型小鼠腦梗死面積[16];MEG3可調控腦卒中后血管新生的功能[17];下調MEG3可減輕過氧化氫誘導的PC12細胞損傷[18]。本研究中模型組小鼠MEG3水平升高,此時小鼠神經功能損傷評分升高,腦含水量升高,血-腦屏障通透性升高,ZO-1、Occludin蛋白表達降低,提示MEG3改變可能與HIBD小鼠的發病有關,MEG3變化可能與血-腦屏障完整性有關。Occludin是體內血-腦屏障功能完整性的關鍵跨膜調節劑。ZO-1是一種膜相關鳥苷酸激酶樣蛋白,將跨膜緊密連接蛋白連接到肌動蛋白細胞骨架上。ZO-1與結復合體的分離導致血-腦屏障通透性增加[19]。血-腦屏障破壞與這些緊密連接蛋白和血-腦屏障轉運蛋白的異常表達有關[20]。ZO-1、Occludin表達的下降導致血-腦屏障完整性受損[21],與本研究一致。當沉默MEG3表達后,小鼠神經功能損傷評分降低,血-腦屏障通透性降低,ZO-1、Occludin蛋白表達升高,提示MEG3沉默可能通過調節ZO-1、Occludin蛋白表達恢復血-腦屏障的阻滯作用,保護HIBD小鼠免受有害物質的侵襲。

miRNA被認為是HIBD發病機制中的關鍵介質。LncRNA通常通過海綿化miRNA調控相關靶基因發揮作用,在HIBD期間,miRNA表達發生顯著變化。miR-17-5p可保護新生小鼠免受HIBD[22]。Chen等[7]研究顯示,miR-17-5p在抑制HIBD新生大鼠炎性激活中發揮作用。本研究中,HIBD模型小鼠miR-17-5p水平降低,提示其在HIBD中發揮作用。研究[8]顯示,miR-17-5p是MEG3的靶標。MEG3沉默可能通過海綿化miR-17-5p降低血-腦屏障通透性。進一步研究表明,在MEG3沉默基礎上抑制miR-17-5p表達后,MEG3的沉默不能顯著減輕HIBD小鼠的神經損傷、腦水腫以及血-腦屏障通透性。MEG3沉默可能通過上調miR-17-5p發揮對HIBD小鼠的神經保護以及血-腦屏障保護作用。

綜上所述,LncRNA MEG3沉默可能通過上調miR-17-5p,降低HIBD新生小鼠血-腦屏障通透性,維持血-腦屏障對大腦的保護作用,保護腦組織。下一步將開展細胞實驗進行進一步驗證。

作者貢獻說明范敏娜指導選題、設計研究,指導起草、修改文章,提供技術材料;李明提出選題,設計、實施研究,采集、分析、解釋數據,撰寫、修改文章