白敏鳳,胡偉,馬寅銳,賈蔚,尹利民(.昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,云南昆明 6504;.昆明市第一人民醫(yī)院泌尿外科,云南 昆明 6504;.昆明市第一人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理辦公室,云南 昆明 6504)
腎移植是終末期腎病患者的最佳治療選擇,是改善終末期腎病患者的生活質(zhì)量和生存率的有效方式。但免疫抑制及感染風(fēng)險(xiǎn)仍然是主要問(wèn)題[1]。巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是影響實(shí)體器官移植(solid organ transplantation,SOT)結(jié)局的最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染之一[2],在不同的腎移植受者中,有40% ~ 100%的患者發(fā)生主動(dòng)感染[3]。CMV與腎移植后肺炎、肝炎、視網(wǎng)膜炎及腎移植后急、慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生有著密切聯(lián)系[2]。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)巨細(xì)胞病毒的方法包括:分子測(cè)定、抗原血癥檢測(cè)、組織病理學(xué)、病毒培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)等。病毒培養(yǎng)法檢測(cè)巨細(xì)胞病毒具有高度特異性,但因靈敏度低和周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)應(yīng)用逐漸減少。組織病理學(xué)是診斷巨細(xì)胞病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn),但由于是侵入性操作,除非在有嚴(yán)重組織受累時(shí)才需要完善該檢查。目前臨床上常規(guī)的CMV 檢測(cè)多數(shù)都是檢測(cè)血清中的IgG、IgM 抗體以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法來(lái)檢測(cè)巨細(xì)胞病毒的感染。但對(duì)于器官移植患者等人群,CMV 活動(dòng)性感染或疾病的有效治療以及采取先發(fā)制人的策略都需要早期、準(zhǔn)確的診斷才能獲得更好的結(jié)果。而移植后腎功能的評(píng)估,肌酐、他克莫司(tacrolimus,Tac/FK506)、淋巴細(xì)胞亞群具有重要的意義。因此,本研究對(duì)CMV 不同檢測(cè)方法進(jìn)行比較,通過(guò)檢測(cè)腎移植患者的肌酐、FK506 藥物濃度、淋巴細(xì)胞亞群等項(xiàng)目,評(píng)估CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)在腎移植患者中的意義。
1.1 研究對(duì)象
1.1.1 一般資料:選取2021 年9 月至2021 年12 月昆明市第一人民醫(yī)院就診90 例腎移植患者的110 例血樣。(其中20 例腎移植患者重復(fù)就診),分別進(jìn) 行CMV pp65 抗 原、CMV IgG、IgM 抗 體、CMV DNA、肌酐、淋巴細(xì)胞亞群、FK506 藥物濃度等檢測(cè)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器:全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、熒光定量PCR 儀、液基薄層細(xì)胞制片機(jī)、全自動(dòng)生化分析儀、BD 流式細(xì)胞儀等
1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑:CMV IgG 抗體檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)、CMV IgM 抗體檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)、HCMV 核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ⑺四緶y(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)、肌酐測(cè)定試劑盒(氧化酶法)、BD Multitest IMK Kit。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)方法建立
1.2.1.1 外周血白細(xì)胞的分離:1 ml BD MultitestTMIMK Lysing Solution 加 入 待 測(cè) 標(biāo) 本100 μl EDTA-K2抗凝全血混勻,離心、棄去上清液,取沉淀加1ml PBS 緩沖液,混勻后(12000 r×1 min)高速離心,計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)量,制成濃度為2×105/ml 外周血白細(xì)胞懸液。
1.2.1.2 細(xì)胞甩片機(jī)制片:取外周血白細(xì)胞懸液100 μl 制得外周血白細(xì)胞玻片。
1.2.1.3 免疫熒光染色:將PBS 1:1000 稀釋后的抗HCMV pp65 單克隆抗體覆蓋玻片,玻片置于37℃溫箱孵育30 min(之后的步驟盡量不要讓玻片干掉),沖洗浸泡,PBS 1:500 稀釋后的FITC 標(biāo)記羊抗鼠IgG 抗體覆蓋玻片,避光37℃溫箱孵育30 min,同樣沖洗浸泡5 min,洗掉未結(jié)合物質(zhì)。封片,避光保存。
1.2.1.4 熒光顯微鏡觀察:陽(yáng)性細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)熒光標(biāo)記,呈黃綠色,鏡下陽(yáng)性細(xì)胞≥1 個(gè),則認(rèn)為該樣本CMV 抗原血癥陽(yáng)性。
1.2.2 CMV IgG、IgM 抗體檢測(cè):待測(cè)樣本分離膠管新鮮血清在MAGLUMI X8 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)。
1.2.3 CMV DNA 檢測(cè) EDTA-K2 抗凝全血1 ml,按照CMV DNA 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.4 一般項(xiàng)目檢測(cè):肌酐、淋巴細(xì)胞亞群、FK506 藥物濃度均按照標(biāo)準(zhǔn)化流程留取標(biāo)本并進(jìn)行檢測(cè)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用t 檢驗(yàn)比較兩組間差異。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Box-Cox 轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料率的組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與CMV DNA 一致性比較:在對(duì)昆明市第一人民醫(yī)院90 例腎移植受體的110 例血液樣本的檢測(cè),CMV pp65 與CMV DNA同時(shí)陰性有45 例,同時(shí)陽(yáng)性有27 例,一致性為65.5%(表1)。經(jīng)Fisher 精確檢驗(yàn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。
2.2 CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與CMV IgG 抗體一致性比較:在對(duì)110 例標(biāo)本的CMV pp65 與IgG 抗體結(jié)果的比較中,CMV pp65 與IgG 抗體同時(shí)陰性1 例,同時(shí)陽(yáng)性有62 例,一致性為57.3%(表2)。經(jīng)Fisher 精確檢驗(yàn),差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。

表2 CMV pp65 結(jié)果與CMV IgG 抗體定性結(jié)果比較
2.3 CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與血清肌酐比較:納入樣本110 例,數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,采用BOXCOX 變換數(shù)據(jù),如表3 所示,CMV pp65 抗原血癥陰性46 例,肌酐平均值為(1.149±0.006)μmol/L,CMV pp65 抗原血癥陽(yáng)性64 例,肌酐平均值為(1.150±0.006)μmol/L,CMV pp65 抗原血癥與肌酐差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =-0.729,P =0.468)。

表3 CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與肌酐的比較
2.4 CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與FK506 藥物濃度比較(表4):納入樣本96 例,數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,采用t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。CMV pp65 抗原血癥陰性39 例,F(xiàn)K506 藥物濃度平均值為(6.25±2.22)ng/ml,CMV pp65 抗原血癥陽(yáng)性57 例,F(xiàn)K506 藥物濃度平均值為(6.63±2.47)ng/ml,CMV pp65 抗原血癥與FK506 藥物濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =-0.768,P =0.445)。

表4 CMV pp65 抗原血癥與FK506 藥物濃度的比較
2.5 CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與淋巴細(xì)胞亞群比較:納入樣本43 例,CMV pp65 抗原血癥陽(yáng)性24 例,陰性19 例。CD8+T 細(xì)胞比例(CD3+CD8+/CD45+)、CD4+T 細(xì)胞比例(CD3+CD4+/CD45+)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;T 細(xì)胞比例(CD3+/CD45+)、NK 細(xì) 胞 比 例(CD16+CD56+/CD45+)、B 細(xì)胞 比 例(CD19+/CD45+)、CD4+T 細(xì) 胞/CD8+T 細(xì) 胞(Th/Ts)、CD3+總T 細(xì) 胞 絕 對(duì) 值、CD8+T 細(xì) 胞(Ts/Tc)絕 對(duì) 值、CD4+T 細(xì) 胞(Th/Ti)絕 對(duì) 值、CD4+CD8+雙陽(yáng)性T 細(xì)胞絕對(duì)值、NK 細(xì)胞絕對(duì)值、B 細(xì)胞絕對(duì)值不符合正態(tài)分布,采用Box-Cox 將非正態(tài)分布數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布。CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與T 細(xì)胞比例(CD3+/CD45+)、CD8+T 細(xì)胞比例(CD3+CD8+/CD45+)、CD4+T 細(xì)胞比例(CD3+CD4+/CD45+)、NK 細(xì)胞比例(CD16+CD56+/CD45+)、B 細(xì)胞比例(CD19+/CD45+)、CD4+T 細(xì) 胞/CD8+T 細(xì) 胞(Th/Ts)、CD3+總T 細(xì)胞絕對(duì)值、CD8+T 細(xì)胞(Ts/Tc)絕對(duì)值、CD4+T 細(xì)胞(Th/Ti)絕對(duì)值、CD4+CD8+雙陽(yáng)性T 細(xì)胞絕對(duì)值、B 細(xì)胞絕對(duì)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與NK 細(xì)胞絕對(duì)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。如表5所示。
表5 CMV pp65 抗原血癥與淋巴細(xì)胞亞群的比較(±s)

表5 CMV pp65 抗原血癥與淋巴細(xì)胞亞群的比較(±s)
Box-Cox 轉(zhuǎn)換前 Box-Cox 轉(zhuǎn)換后淋巴細(xì)胞亞群t P陰性 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性T 細(xì)胞比例(CD3+/CD45+)56.50±24.22 67.24±21.11 751.13±364.59 760.00±386.51 -0.077 0.939 CD8+T 細(xì)胞比例(CD3+CD8+/CD45+)CD4+T 細(xì)胞比例(CD3+CD4+/CD45+)NK 細(xì)胞比例(CD16+CD56+/CD45+)B 細(xì)胞比例(CD19+/CD45+)CD4+T 細(xì)胞/CD8+T 細(xì)胞(Th/Ts)31.00±12.57 35.24±14.65 31.00±12.57 35.24±14.65 0.596 0.554 23.32±14.49 29.67±14.73 23.32±14.49 29.67±14.73 -0.639 0.527 18.14±13.41 13.10±6.99 5.52±2.49 4.22±1.97 1.912 0.063 24.18±27.29 18.24±19.68 1.96±0.80 2.28±0.66 -1.456 0.153 0.75±0.41 0.94±0.59 -0.37±0.55 -0.17±0.56 -1.191 0.241 CD3+總T 細(xì)胞絕對(duì)值 1.00±0.91 0.87±0.77 -0.10±1.01 -0.54±0.89 1.524 0.135 CD8+T 細(xì)胞(Ts/Tc)絕對(duì)值0.51±0.48 0.40±0.30 -0.64±0.73 -1.02±0.57 1.905 0.064 CD4+T 細(xì)胞(Th/Ti)絕對(duì)值CD4+CD8+雙陽(yáng)性T 細(xì)胞絕對(duì)值0.43±0.45 0.43±0.49 -0.99±0.99 -1.25±0.92 0.887 0.380 0.01±0.02 0.01±0.01 -6.63±2.23 -7.21±1.61 0.973 0.337 NK 細(xì)胞絕對(duì)值 0.29±0.31 0.15±0.14 -1.24±0.75 -1.73±0.67 2.247 0.030 B 細(xì)胞絕對(duì)值 0.18±0.14 0.15±0.11 -1.77±0.70 -1.80±0.55 0.161 0.873
CMV 是影響SOT 預(yù)后的一個(gè)重要的病原微生物,在腎移植術(shù)后不僅常見(jiàn),而且嚴(yán)重影響腎移植的發(fā)病率和病死率[4-6]。CMV 復(fù)制存在于組織、血液或其他體液中,與癥狀無(wú)關(guān),可通過(guò)核酸檢測(cè)(NAT)、抗原檢測(cè)和病毒培養(yǎng)法來(lái)檢測(cè) CMV 的復(fù)制。根據(jù)所使用的方法,血液中的 CMV 復(fù)制可以稱為CMV DNA 血癥 、CMV 抗原血癥和CMV 病毒血癥[7-8]。CMV DNA 檢測(cè)是目前首選的診斷CMV感染的方法,被廣泛地用于臨床中診斷 CMV 疾病,確定何時(shí)開始先發(fā)性抗病毒治療(PET)以及監(jiān)測(cè)感染和/或疾病進(jìn)程[9-10],但該方法在區(qū)分潛伏性或活動(dòng)CMV 感染方面具有一定局限 性。 而CMV pp65 抗 原 血 癥 通 過(guò) 檢 測(cè)CMV pp65 抗 原 來(lái) 診 斷CMV 感 染。pp65 抗 原 在CMV DNA 復(fù)制前就有合成,在出現(xiàn)臨床癥狀前2 ~ 10 d 內(nèi)可明顯增高,CMV pp65 抗原陽(yáng)性提示體內(nèi)活動(dòng)性巨細(xì)胞病毒復(fù)制完成,是HCMV 活動(dòng)性感染的早期標(biāo)志性產(chǎn)物[11]。腎移植患者對(duì)活動(dòng)性感染或疾病的有效治療以及采取先發(fā)制人的策略都需要準(zhǔn)確、早期的診斷才能獲得更好的結(jié)果,因此需要快速且準(zhǔn)確的診斷方法[6]。目前對(duì)腎移植進(jìn)行移植后監(jiān)測(cè)的策略包括連續(xù)測(cè)量血清肌酐水平、臨床隨訪以及腎臟活檢等[12]。肌酐是目前常用的評(píng)估SOT后患者腎功能的常用指標(biāo)。腎移植術(shù)后患者常規(guī)服用免疫抑制劑包括環(huán)孢素A、他克莫司等,通過(guò)調(diào)整免疫抑制劑的劑量來(lái)保持患者的免疫系統(tǒng)平衡。因此,在移植后監(jiān)測(cè)患者的血藥濃度、健康狀況,以確保不會(huì)發(fā)生這些并發(fā)癥[1]。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定,T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、輔助/誘導(dǎo)性T 淋巴細(xì)胞及抑制/細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)可用于表征和監(jiān)測(cè)某些形式的免疫缺陷及自身免疫疾病。
由于CMV 對(duì)臨床預(yù)后的負(fù)面影響,腎移植后的預(yù)防是非常重要的治療措施。對(duì)于腎移植術(shù)后CMV 感染預(yù)防有兩大基本策略:抗病毒預(yù)防性治療和搶先治療。為了確保搶先治療的有效性,需要對(duì)移植患者進(jìn)行定期(每周1 次)的CMV pp65 抗原等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),得到CMV 感染的早期證據(jù)從而獲得更好的長(zhǎng)期生存率。因此,如何早期靈敏快速診斷CMV 感染對(duì)腎移植患者意義重大。本研究將自建的CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)方法與CMV DNA 等方法進(jìn)行比較,將CMV pp65 抗原血癥的檢測(cè)與CMV DNA 檢測(cè)結(jié)合,對(duì)臨床及時(shí)準(zhǔn)確診斷CMV 感染具有一定意義。
3.1 CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)與CMV IgG 抗體、IgM抗體及CMV DNA 結(jié)果討論:本研究對(duì)110 例腎移植后樣本進(jìn)行CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)的同時(shí),對(duì)CMV IgG 抗體、IgM 抗體及CMV DNA 也進(jìn)行檢測(cè)。
血清學(xué)檢測(cè)CMV IgG 抗體及IgM 抗體是用來(lái)證明CMV 感染最常用的方法。本實(shí)驗(yàn)用化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)腎移植后110 例樣本的CMV IgG 抗體、IgM抗體,110 例樣本的IgM 抗體結(jié)果均為陰性,CMV IgM 抗體最初是在早期CMV 感染過(guò)程中分泌的,若通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)到CMV IgM 抗體則表明是活躍,急性或近期感染,但由于腎移植病人應(yīng)用免疫抑制劑,影響IgM 抗體檢測(cè)結(jié)果,IgM 抗體陽(yáng)性率低,不適合做早期診斷的指標(biāo),本實(shí)驗(yàn)IgM 抗體則不納入討論。兩種方法與IgG 抗體比較,CMV pp65與IgG 抗體同時(shí)陽(yáng)性有62 例,同時(shí)陰性有1 例。CMV IgG、IgM 血清學(xué)檢測(cè)在診斷腎移植術(shù)后CMV病方面的作用有限,移植受者由于接受免疫抑制治療,CMV 感染后產(chǎn)生抗體的時(shí)效性和能力都會(huì)受到限制[13]。
CMV DNA 檢測(cè)是目前主要用于CMV 感染的檢測(cè)方法,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法定量分析CMV DNA 的表達(dá)情況,從而判斷巨細(xì)胞病毒感染的狀況。由于其高靈敏度和高通量,已成為首選的診斷測(cè)試方法。因此,它被廣泛地用于臨床診斷 CMV 疾病,確定何時(shí)開始先發(fā)性抗病毒治療以及監(jiān)測(cè)CMV 感染和/或疾病進(jìn)程[10-11]。在本研究對(duì)CMV pp65 抗原血癥與CMV DNA 結(jié)果比較,CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)結(jié)果與CMV DNA 同時(shí)陰性有45 例,同時(shí)陽(yáng)性有27 例。CMV pp65 抗原陽(yáng)性、DNA 陰性的樣本,可能是由于CMV pp65抗原出現(xiàn)時(shí)間較DNA 出現(xiàn)早,DNA 未能及時(shí)檢出,也可能由于CMV DNA 檢測(cè)靈敏度不夠。CMV pp65 抗原陰性、DNA 陽(yáng)性的樣本,可能是由于抗原血癥的檢測(cè)對(duì)白細(xì)胞數(shù)量有一定要求,而在顯微鏡下觀察有無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞存在操作者主觀因素的影響。
在研究過(guò)程中,其中1 例腎移植術(shù)后患者發(fā)熱原因不明,臨床排除細(xì)菌及真菌感染,多次全血CMV DNA 結(jié)果均為陰性,而該患者CMV pp65 抗原血癥陽(yáng)性,提示CMV 感染導(dǎo)致的發(fā)熱不除外。經(jīng)二代測(cè)序驗(yàn)證,該患者檢出CMV 感染。予以抗病毒治療,臨床癥狀好轉(zhuǎn)。該案例反映CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)能夠早期發(fā)現(xiàn)CMV 復(fù)制,對(duì)CMV 感染的早期診斷有較大價(jià)值。該案例也反映出目前全血CMV DNA 檢測(cè)可能存在靈敏度不足的問(wèn)題。因此,將CMV pp65 抗原血癥的檢測(cè)與CMV DNA 檢測(cè)結(jié)合,對(duì)臨床及時(shí)準(zhǔn)確診斷CMV 感染具有一定意義。
3.2 CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)與肌酐、FK506 藥物濃度及淋巴細(xì)胞亞群等之間的相關(guān)性:CMV 感染與急性排斥反應(yīng)和慢性同種異體移植損傷相關(guān),包括在腎移植后患者中的慢性同種異體腎病[2,13],肌酐、FK506 藥物濃度及淋巴細(xì)胞亞群是評(píng)估移植腎損傷的幾個(gè)有效指標(biāo)。在本研究中,CMV pp65抗原血癥檢測(cè)結(jié)果與肌酐、FK506 藥物濃度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CMV pp65 抗原血癥在反映CMV 感染方面意義尚不明確。但不排除實(shí)驗(yàn)操作直接影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果:樣本數(shù)量收集不足導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果有差異,患者是否能夠遵醫(yī)囑服藥、免疫抑制狀態(tài)下是否有其他病毒及細(xì)菌感染、患者移植術(shù)后的時(shí)間以及是否發(fā)生移植排斥反應(yīng)等外源性因素都會(huì)干擾肌酐、FK506 結(jié)果從而直接影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
細(xì)胞免疫的測(cè)定即對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和/或功能進(jìn)行檢測(cè),已成為一種臨床工具,可幫助SOT 后CMV 風(fēng)險(xiǎn)分層和管理[2,14]。在本研究中, CMV pp65 抗原血癥結(jié)果與NK 細(xì)胞絕對(duì)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),CMV pp65 抗原血癥陽(yáng)性的樣本NK 細(xì)胞絕對(duì)值均低于pp65 陰性的樣本。NK 細(xì)胞絕對(duì)值一定程度上可以用來(lái)評(píng)估CMV感染。
CMV pp65 抗原血癥檢測(cè)與CMV IgG 抗體結(jié)果比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CMV pp65 抗原與CMV DNA 結(jié)果一致性為65.5%,兩種方法聯(lián)合檢測(cè),對(duì)提高CMV 感染臨床診斷準(zhǔn)確率具有一定意義。
在CMV pp65 抗原陰性組與陽(yáng)性組中,血清肌酐水平、全血FK506 藥物濃度兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在CMV pp65 抗原陰性組與陽(yáng)性組中,NK 細(xì)胞絕對(duì)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NK 細(xì)胞絕對(duì)值偏高的腎移植患者,發(fā)生CMV 感染的概率偏低。