基于網絡藥理學及分子對接探究地參三萜酸保肝作用機制

楊勤，李金金，周濃

（1.重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶 404120；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120）

肝臟為人體五臟之一，可維持人體新陳代謝的穩定，具有造血、代謝營養物質、排解體內毒素、分泌和排泄膽汁等生理功能。生物性病原菌、藥物及肝毒性物質、免疫性低下、酒精刺激及營養物質缺乏等因素均會引起肝損傷。長期反復的肝損傷會破壞肝臟組織的正常結構，肝臟的各種功能減弱從而導致肝再生能力降低。因而進一步研究有效的生物活性成分并探明其對肝功能的促進再生、修復作用機制具有重要的意義。

地參（Lycopus lucidus Turcz.）為唇形科藥材澤蘭的地下部分，形似地蠶，氣香、味甘，是良好的藥食同源植物資源[1-2]。地參藥用價值在眾多典籍皆有記載，具有化瘀止血、益氣利水、氣虛乏力之功效。近年來的研究表明，地參具有保肝[3]、抗氧化[4]、降血糖血脂[5-6]等功能，其提取物中含有的三萜類物質有降低肝硬化、保護肝臟功能的作用。參考前期實驗[4]，地參中三萜酸生物活性已有研究，含量依次為白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸，三種化合物都為五環三萜化合物，其單一化合物均有改善肝臟疾病的相關文獻報道，徐立新[7]等研究表明白樺脂酸可通過緩解脂質過氧化和氧化應激改善（四氯化碳）CCl4誘導肝損傷；張明發[8]等研究表明熊果酸和齊墩果酸的抗氧化作用能對抗各種原因引起的氧化應激所致的肝組織炎性損傷、脂肪變和纖維化。為探討地參中萜類對肝臟保護作用的潛在機制，本研究構建網絡藥理學及分子對接來對地參萜類成分保肝機制進行闡釋。

一、資料與方法

（一）地參活性成分檢索

利用TCMSP數據庫檢索地參活性化學成分，研究針對地參中主要萜類成分，結合地參有藥理作用成分的生物活性成分參考，預測地參萜類的保肝作用機制。

（二）地參三萜酸藥理成分對應靶點的獲取

白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸三種萜類結構通過使用Pubchem數據庫獲得，將獲取的化學式結構導入PharmMapper數據庫和Swiss Target Prediction數據庫，進而可得作用靶點，輸入至uniprot數據庫，再將靶點名稱矯正統一，經去重后獲得所需靶點。

（三）保肝相關靶點的篩選

在數據庫檢索“liver protection”相關的靶點基因，通過Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺分析地參萜類成分和疾病靶點信息的篩選結果，圖示可直觀得到共同靶點。

（四）藥物-疾病-共同靶點的篩選

將有效成分靶點和關鍵通路導入軟件進行可視化處理，并對各藥物化學成分進行形狀、顏色識別標注，化學成分與靶點的關系使用Network Analyzer功能對三萜酸的主要活性成分進行分析。

（五）構建靶蛋白相互作用網絡

在STRING數據庫獲得交集作用靶點，明確萜類保肝靶點之間的相互作用，構建PPI網絡圖。基于拓撲分析的核心靶點篩選如下，導入Cystoscap 3.9.1中，拓撲分析由Network analyzer插件分析，根據degree值選取核心的靶點。

（六）GO 富集及KEGG 富集

將地參三萜酸保肝潛在作用靶點信息導入David（生物學信息注釋數據庫）數據庫分別勾選生物過程、分子功能、細胞組成、KEGG 信號通路，利用R語言的Clusterprofile程序包進行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析,設定PValue ≤0.05得到相應的生物學過程及KEGG通路相關數據，然后將所得KEGG數據導入Cytoscape 3.7.2進行可視化圖形繪制。

（七）分子對接

配體處理：從Pubchem數據庫下載化合物的SDF格式，導入Chemdraw 3D中，利用MM2模塊進行能量最小化，獲得能量最低的優勢構象并保存為mol2文件，并使用AutodockTools1.5.6對配體進行加氫、加電荷、檢測配體的root、進行可旋轉鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件。

受體處理：從RCSB PDB數據庫下載得到蛋白的三維結構，利用PYMOL對蛋白進行去水分子、去小分子，再通過AutodockTools1.5.6添加氫原子、計算Gasteiger電荷，將其定義為受體并保存成pdbqt文件。

對接過程：使用Autodock vina 1.1.2將配體與受體進行對接，選取對接結合能最低的構象用于對接結合模式分析，并用PYMOL分析結合模式并進行可視化。

二、結果分析

（一）三萜酸成分及靶點篩選

通過TCMSP數據庫檢索澤蘭篩選出三萜酸活性成分，選取白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸三種三萜酸類研究其保肝作用，并使用Pubchem數據庫獲得三種三萜酸的結構，導入PharmMapper數據庫（取Norm Fit預測得分大于0.6的靶點）和Swiss Target Prediction數據庫獲取作用靶點，經uniprot數據庫對靶點名稱矯正統一并去重后共獲得185個靶點。

（二）疾病作用靶點篩選

以“liver protection”為關鍵詞分別在數據庫（取relevance score大于10的靶點）進行檢索，去重后共獲得疾病靶點833個。

（三）藥物-疾病-共同靶點的篩選

將185個藥物靶點、833個疾病靶點輸入至線上軟件作圖工具平臺中，由兩者取交集后獲得藥物-疾病交集靶點58個（見圖1）。

圖1 三萜酸與肝保護靶點韋恩圖

（四）成分-靶點-疾病網絡構建及分析

三萜酸的主要活性成分進行分析后，采用Cytoscape軟件，將三萜酸中3個潛在活性成分與58個藥物-疾病共同靶點分析，“成分-靶點-疾病”網絡圖繪制如圖所示 （圖2）。3種活性成分由黃色代表，藍色代表58個共同靶點，紅色代表疾病。通過圖2可以看出地參中三萜酸成分對應靶標來發揮對肝臟的保護作用。

圖2 活性成分-靶點-疾病網絡圖

（五）PPI 網絡構建及核心靶點分析

構建蛋白相關作用關系網絡圖 ：將上述藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數據庫中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.7，去除孤立節點，構建蛋白相互作用的PPI網絡（圖3）。PPI網絡中，一個基因靶點由每個節點表示，兩個靶點之間的相互作用關系用線線連接。將PPI網絡導入Cystoscap 3.9.1中，通過Network Analyzer工具進行拓撲分析，選取degree值大于平均分的基因作為核心靶點，在條形圖（圖4）中可得度值最高的3個靶點是HSP90AA1（度值20）、MAPK3（度值20）、MAPK1（度值19）。

圖3 PPI網絡

圖4 核心靶點排序

（六）GO 富集及KEGG 富集

使用David數據庫對共同靶點進行GO與KEGG富集分析，并使用R語言對富集結果進行可視化，將58個共同靶點經David數據庫GO富集分析得到生物學過程、細胞組分及分子功能3部分。GO結果顯示，交集基因共富集至281條生物過程通路中；交集基因共富集至33條細胞組分表達過程中；交集基因共富集至76條分子功能相關的過程中，選取每部分Pvalue排名前10的通路繪制條形圖氣泡圖（圖5）。將58個共同靶點經David數據庫KEGG富集分析后共得到126條KEGG通路，選取Pvalue排名前20的通路繪制KEGG富集的條形圖氣泡圖（圖6），-log10(Pvalue)代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。注：一般選擇Pvalue ＜0.05的通路進行研究。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集分析

（七）分子對接

分子對接常用于藥物活性分子與靶蛋白的對接分析。將Degree值前5個重要靶點蛋白HSP90AA1、MAPK1、MAPK3、SRC、EGFR，以及3個活性成分Betulinic acid（白樺脂酸）、Oleanolic acid（齊墩果酸）、Ursolic Acid（熊果酸）進行分子對接驗證。由表1可知，地參中三萜酸靶點的結合能均＜-7.3 kcal/mol，即結合性較好。由圖7可知，這些化合物主要與蛋白受體結合位點發生氫鍵作用。

表1 三萜酸與關鍵靶點對接能

圖7 分子對接結合能熱圖

利用Autodock vina對接，化合物和蛋白的最低結合能結合自由能（Affinity）越小表示化合物能夠強有力自發地結合到蛋白的活性口袋中，小分子能夠良好地進入到蛋白的活性口袋具有良好的形狀匹配，利用PYMOL進行相互作用分析，從三維分析發現，化合物與氨基酸形成的氫鍵相互作用，這些相互作用使得化合物能夠良好地結合到蛋白口袋中，進一步發揮作用。由圖8（A）所示，化合物和蛋白的最低結合能為-9.2kcal/mol，結合能小于-7，從三維分析發現，化合物與氨基酸ALA165形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.1埃。由圖8（B）所示，化合物和蛋白的最低結合能為-10.4kcal/mol，結合能小于-7，從三維分析發現，化合物與氨基酸MET108、THR110形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離分別為3.4、2.1、2.6埃。由圖8（C）所示，化合物和蛋白的最低結合能為-9.8kcal/mol，結合能小于-7，化合物與氨基酸ARG41形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.5埃，由圖8（D）所示，化合物和蛋白的最低結合能為-9.9kcal/mol，結合能小于-7，化合物與氨基酸ARG156形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.5埃。由圖7（E）所示，化合物和蛋白的最低結合能為-10.1kcal/mol，結合能小于-7，化合物與氨基酸LYS745形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離分別為2.4、2.2埃。

圖8 地參3 種化合物與關鍵靶點相互作用圖

三、討論

本研究以地參三種五環三萜酸活性成分構建網絡藥理學，建立成分-疾病-靶點的關聯網絡，得出潛在作用靶標58個，根據這些靶標進一步收集三萜酸保肝作用過程及富集通路。

PPI網絡及核心靶點排序中度值排名前三的關鍵靶點HSP90AA1、MAPK3、MAPK1與肝功能作用相關，HSP90系列是目前世界上性能最優越的肝癌標志物，可用于肝癌患者的病情監測和療效評估[9]。MAPK是肝細胞內促細胞增殖和傳遞應激信號的關鍵激酶，肝IRI中的一個重要因子，MAPK在肝再灌注后迅速通過磷酸化被激活,參與誘導細胞凋亡壞死,肝纖維化也與MAPK有關[10-11]。GO生物學富集結果表明，前3位的富集過程包括negative regulation of apoptotic process、response to ethanol、response to toxic substance。通過KEGG富集分析,得到前5的信號通路為Pathways in cancer、Prostate cancer、Proteoglycans in cancer、Chemical carcinogenesisreceptor activation、Endocrine resistance。地參萜類保肝主要通過這些重要信號通路進行調控。用分子對接技術分析結果可得，HSP90AA1、MAPK1、MAPK3、SRC、EGFR靶點的結合能均＜-7.3 kcal/mol，說明萜類活性成分與靶點間結合力好，構象穩定。結合能越低，說明結合越穩定，其中HSP90AA1結合能力最佳。由試驗結果分析，以微觀的分子角度系統可預測分析地參三萜酸保肝的作用機制，對分析為其預防、修復肝臟功能等提供證據支持。

四、結論

綜上所述，基于網絡藥理及分子對接技術，初步探究了地參三萜酸活性成分保肝可能的作用機制，為其對保肝臨床應用的合理性、有效性、精準性提供理論依據，為地參中潛在活性成分后續研究奠定理論基礎。網絡藥理學及分子對接理論性較強，對探究地參三萜酸成分的保肝作用機制有一定的限制性，篩選條件所限，僅對地參萜類有效成分及主要作用靶點進行了分析，已篩出萜類的靶標和途徑，但其作用機理還需進一步進行實驗驗證。