黃曲霉毒素在肉雞肝臟中的代謝規律研究

張蓉銀，杜婷婷，魏佩玲，王曉濤，胡 波

（新疆畜牧科學院畜牧業質量標準研究所，新疆烏魯木齊 830026）

霉菌毒素是由曲霉菌、鐮刀菌、青霉菌和鏈格孢菌等真菌產生的天然有毒次級代謝產物（Steynp，1995），迄今為止，已在自然界中發現了超過500 多種霉菌毒素。其中黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由曲霉菌產生的毒性最強的毒素，具有肝毒性、致癌性、誘變性和致畸性（Johan等，2010），也是污染玉米、花生、小麥、堅果、油性飼料、飼草產品等飼料原料的主要污染毒素（史海濤等，2019 ；黎進，2016）。畜禽受黃曲霉毒素中毒后其肝臟酶活、組織形態異常嚴重影響了肝臟功能（Cast，1989）。因此，研究AFB1在靶組織中的代謝規律受到廣泛關注。本文選用白羽肉雞為研究對象，利用非靶向代謝組學方法探討不同濃度的黃曲霉毒素對肉雞肝臟組織的影響，為實際養殖過程中檢測黃曲霉毒素提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 試驗將80 只21 日齡、平均體重816 g 的白羽肉雞隨機分為4 組，分別為對照組（DZ）、低劑量組（D）、中劑量組（Z）、高劑量組（G）。每組4 個重復，每個重復5 只。采用層疊籠養，自由采食和飲水，常規免疫。對照組飼喂基礎日糧，試驗組以玉米油作為溶劑進行注射器灌服，低劑量組灌服濃度為2.4μg/mL；中劑量組灌服濃度10μg/mL 的AFB1；高劑量組灌服100μg/mL的AFB1，每天灌服1 次，每次1 mL，連續灌服7 d。

1.2 主要試劑與設備

1.2.1 試劑 甲醇、甲酸、水、乙腈試劑均購自Finsher 公司，均為分析純或色譜級。

1.2.2 主要儀器 SB-5200DT 超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限公司）；TYXH-I 漩渦振蕩器（上海汗諾儀器有限公司）；TGL-16MS 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；LNG-T98 冷凍濃縮離心干燥機（太倉市華美生化儀器廠）；Sciex TripleTOF 6600 高分辨質譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Agilent 1290 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8μm）色譜柱（Waters）。

1.2.3 肉雞屠宰和肝臟樣品采集 飼喂前各試驗組分別屠宰5 只肉雞，其余肉雞待藥物灌服7 d后統一屠宰。宰前稱重，記錄宰前活重、每日飼喂量。屠宰時采用頸動脈放血法，去除頭、羽、爪部位，完整采集雞肝臟樣本，液氮保存。

1.2.4 代謝物提取 取0.1 g 肝臟樣品，加入80% 預冷的甲醇1 mL，使用組織勻漿機將肝臟充分研磨。研磨后的樣品在4℃的條件下15000g離心15 min，收集上清液，經旋蒸干燥后，加入1mL 50% 的甲醇復溶，過0.22μm 濾膜過濾后進行LC-MS/MS 分析。

1.2.5 液相色譜- 質譜條件 色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱溫：45℃；流動相：A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.35 mL/min；進樣體積：2μL。

表1 洗脫梯度

表2 質譜參數

1.2.6 代謝物鑒定和統計分析 使用MSDIAL 4.9 對原始數據做峰提取、峰對齊等數據處理，基于MS-DIAL metabolomics MSP 數據庫進行鑒定，同時進行理論碎片識別。分析前先對數據進行歸一化處理，采取總峰面積歸一化即每個樣本的每個代謝物除以該樣本總的峰面積。

2 結果與分析

2.1 對肉雞生長性能的影響 由表3 可知，與對照組相比，高濃度組對肉雞平均日增重產生顯著影響（P＜0.05），高、中、低組對肉雞的平均日采食量無顯著影響（P＞0.05），各飼喂組均未出現肉雞死亡狀況。

表3 AFB1 對肉雞生長性能的影響

2.2 灌服AFB1對肝臟代謝的影響 采用非靶向代謝組學分析流程，使用C18 分離肝臟代謝物，于正、負離子兩種質譜模式進行數據采集，共鑒定到4473 個代謝物，使用PCA 無監督多維方法分析不同劑量組與對照組定量結果。由圖1 可知，與對照組相比，灌服AFB1的代謝物明顯發生了變化，但不同劑量之間差異不顯著。

圖1 肝臟中不同劑量組間的PCA 得分圖

圖2 肝臟中不同劑量組間的代謝差異物火山圖

2.3 肉雞中AFB1的差異代謝物火山圖分析 為了進一步分析AFB1影響肝臟代謝物的種類，采用T-test 的方法分別分析了低，中、高組相比對照組中差異代謝物的變化趨勢，在變化倍數≥2 倍，P＜0.05 的條件下共鑒定到242 個化合物，其中132 個化合物上調，110 個化合物下調。以火山圖展示代謝物表達差異的分布，其中橫軸表達代謝物差異倍數，越偏離中心差異倍數越大，縱軸值越大差異越顯著。如圖2 所示，其中低劑量組有37個差異化合物顯著下調，30 個差異化合物顯著上調；高劑量組有36 個差異化合物顯著下調，46個差異化合物顯著上調；中劑量組中44 個差異化合物顯著下調，52 個差異化合物顯著上調。

2.4 肉雞中AFB1差異代謝物的層次聚類分析為進一步展示受影響的化合物在肝臟中的變化情況，使用熱圖對不同劑量組進行聚類分析，如圖3所示，其中橫軸表示低（D）、中（Z）、高組（G）和對照組（DZ），縱軸表示相應差異代謝物，紅色越深代表該代謝物相對調高，綠色越深代表該代謝物相對調低。由圖3 可知，各劑量組中的差異代謝物種類與對照組相比變化明顯，可能是由于AFB1劑量升高，導致對肝臟代謝功能造成相應程度的損傷。

圖3 肝臟中不同劑量組間層次聚類分析熱力圖

2.5 肉雞肝臟中的顯著性差異代謝物 由表4可知，在242 個差異化合物中，與對照組相比，低、中、高劑量組上調的差異化合物132 個，下調的差異化合物110 個。經HMDB 數據庫比對進一步篩選出變化最為顯著的內源性代謝物10 個，其中上調的代謝物9 個，下調的代謝物1 個。

表4 各試驗組肉雞肝臟中顯著性差異代謝物信息

3 討論

動物采食AFB1后會引起采食量下降、料重比、日增重增加，更有甚者還會對肝臟、腎臟、胸腺等器官造成一定損傷，長期采食會導致動物的肝、腎、肌肉等產品中沉積AFB1，從而通過食物鏈危害人體健康。Siloto 等（2013）在飼料中加入1 mg/kg 的AFB1，結果發現，雞肝臟顏色變黃，肝臟發生明顯的脂肪蓄積，肝臟重量增大，血漿極低密度脂蛋白和甘油三酯濃度下降。石達友等（2010）研究表明，給雛鴨服用AFB1后，肝臟線粒體膜通透性的變化趨勢與AFB1劑量成正相關性，即AFB1劑量越大，線粒體受損傷程度越嚴重，這可能是AFB1肝毒作用機理之一。Ishikawa 等（2017）研究表明，毒素濃度與肝臟損傷之間存在直接相關性。

在本試驗中，肉雞采食含有AFB1的日糧后發現，肝臟中均有一定程度的蓄積，其中高濃度產生的代謝產物變化，且隨AFB1濃度的升高，代謝產物變化種類越多。肝臟中差異化合物分子大多為脂類和氨基酸類物質，磷脂是構成質膜的主要成分，與其他兩組相比，高劑量處理組中的磷脂類物質顯著升高，這與LU 等（2011）的研究結果一致，說明高劑量的AFB1可導致肝臟損傷，內源性脂類物質迅速增加，發生肝臟脂肪堆積，膜崩解和急性細胞腫脹。Harvey 等（1990）研究發現，通過給豬飼喂AFB1污染的日糧，其肝臟、腎臟和肝臟脂肪的相對重量明顯升高。這與本試驗結果一致。

4 結論

綜上所述，通過AFB1對肉雞肝臟組織的代謝組學分析發現，白羽肉雞采食含有AFB1的飼料后會引起肝臟組織內不等量殘留，且隨著飼料中AFB1濃度的增加，加重了肝臟的損傷情況。