膚癢顆粒中9 種成分含量同時測定及其化學模式識別研究

肖春霞，黃曉婧，許 莉，李婷婷，李 及，趙小勤

（成都市藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局中藥材質量監測評價重點實驗室，四川 成都 610045）

膚癢顆粒由蒼耳子（炒、去刺）、地膚子、川芎、紅花、白英5 味中藥組成，具有祛風活血、除濕止癢功效，用于治療皮膚搔癢、濕疹、蕁麻疹等皮膚病［1］，目前該制劑質量執行標準收錄于《中華人民共和國衛生部藥品標準（中藥成方制劑） 》第六冊，但只有性狀項、理化鑒別項、制劑通則檢查項，無專屬性質量控制項目［1］，而局頒標準中的含量測定項也僅涉及阿魏酸或羥基紅花黃色素A，難以有效控制其整體質量［2］。本實驗選擇膚癢顆粒中蒼耳子、紅花、川芎、白英特征性成分，包括新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A，采用UHPLC 法測定其含量［3-4］，并進行化學模式識別［5-6］，以期為更全面地控制該制劑質量提供參考。

1 材料

Waters Acquity H class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； XPE26 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，0.001 mg）； AUX220 電子天平（日本島津公司，0.1 mg）； SK250H 超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）； 20～200 μL 移液槍（德國Eppendorf 公司）； 超純水制備系統（美國Millipore 公司）。

綠原酸（純度96.8%，批號110753-201817）、咖啡酸（純度99.7%，批號110885-201703）、羥基紅花黃色素A （純度93.1%，批號111637-201810）、阿魏酸 （純度99.4%，批號110773-201915） 對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供； 新綠原酸對照品 （ 純度≥98%，批號19042305） 由成都普菲德生物技術有限公司提供；隱綠原酸對照品 （純度99.1%，批號MUST-20042403） 由成都曼斯特生物科技有限公司提供；洋川芎內酯I （純度≥98.0%，CAS 號94596-28-8，批號CFS202002）、洋川芎內酯H （純度≥98.0%，CAS 號94596-27-7，批號CFS202001）、洋川芎內酯A （純度≥98.0%，CAS 號62006-39-7，批號CFS202002） 對照品均由上海源葉生物科技有限公司提供。

乙腈為色譜純，購自美國Thermo 公司； 磷酸為色譜純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇為分析純，購自廣東光華科技股份有限公司；水為超純水。

膚癢顆粒共120 批，來自6 家企業，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC ? BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相乙腈（A） -0.01% 磷酸 （B），梯度洗脫 （0 ～25 min，3% ～4%A； 25 ～30 min，4% ～10%A； 30 ～40 min，10% ～18% A； 40 ～48 min，18% ～30% A； 48 ～55 min，30% ～50% A； 55 ～58 min，50% ～70% A；58～60 min，70%A）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長0 ～21 min 325 nm，21 ～25 min 390 nm，25～40 min 322 nm，40 ～60 min 278 nm；進樣量1 μL。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取咖啡酸、洋川芎內酯H 對照品適量，25%甲醇制成每1 mL 分別含兩者0.638 6、0.286 5 mg 的溶液，作為對照品溶液①； 精密稱取洋川芎內酯I 對照品適量，25%甲醇制成每1 mL 含0.804 5 mg 該成分的溶液，作為對照品溶液②； 精密稱取洋川芎內酯A 對照品適量，25%甲醇制成每1 mL 含0.743 6 mg 該成分的溶液，作為對照品溶液③； 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸對照品適量，置于25 mL 量瓶中，25%甲醇溶解，精密加入對照品溶液①、③各1 mL，對照品溶液②2.5 mL，25%甲醇定容至刻度，即得每1 mL 分別含新綠原酸0.203 9 mg、咖啡酸0.025 5 mg、綠原酸0.384 9 mg、隱綠原酸0.403 5 mg、羥基紅花黃色素A 0.621 9 mg、阿魏酸0.095 9 mg、洋川芎內酯I 0.080 5 mg、洋川芎內酯H 0.011 5 mg、洋川芎內酯A 0.029 7 mg 的貯備液，精密吸取1.25 mL，置于50 mL 量瓶中，25% 甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL分別含新綠原酸5.097 5 μg、咖啡酸0.637 5 μg、綠原酸9.622 5 μg、隱綠原酸10.087 5 μg、羥基紅花黃色素A 15.547 5 μg、阿魏酸2.397 5 μg、洋川芎內酯I 2.012 5 μg、洋川芎內酯H 0.287 5 μg、洋川芎內酯A 0.742 5 μg 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 參考文獻［7-8］ 報道，精密稱取本品粉末1.0 g 或0.6 g （低蔗糖） 或0.3 g（無蔗糖），置于錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方和工藝，分別制成缺紅花，缺川芎，缺蒼耳子、川芎和白英的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1” 項下貯備液適量，25%甲醇稀釋成系列質量濃度，分別精密吸取1 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其進樣量（X） 進行回歸［6］，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得各成分峰面積RSD 分別為新綠原酸0.83%、咖啡酸2.11%、綠原酸0.70%、隱綠原酸0.93%、羥基紅花黃色素A 0.92%、阿魏酸0.88%、洋川芎內酯I 0.71%、洋川芎內酯H 0.67%、洋川芎內酯A 1.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密稱取本品（S1） 1 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、20、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD 分別為新綠原酸0.90%、咖啡酸2.35%、綠原酸0.44%、隱綠原酸0.66%、羥基紅花黃色素A 0.81%、阿魏酸0.43%、洋川芎內酯I 0.49%、洋川芎內酯H 0.49%、洋川芎內酯A 1.94%，表明溶液在24 h 穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一份本品（S1），研細，精密稱取6 份，每份1 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各成分含量RSD 分別為新綠原酸2.24%、咖啡酸1.58%、綠原酸1.76%、隱綠原酸2.48%、羥基紅花黃色素A 2.83%、阿魏酸2.68%、洋川芎內酯I 1.15%、洋川芎內酯H 1.06%、洋川芎內酯A 2.42%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品（S1） 9 份，每份0.5 g，分為3 組，分別精密加入對照品溶液 （每1 mL 含新綠原酸40.78 μg、咖啡酸5.10 μg、綠原酸76.98 μg、隱綠原酸80.70 μg、羥基紅花黃色素A 124.38 μg、阿魏酸19.18 μg、洋川芎內酯I 16.10 μg、洋川芎內酯H 2.30 μg、洋川芎內酯A 5.94 μg） 1、2、3 mL，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A 平均加樣回收率分別為97.14%、95.50%、96.80%、96.91%、99.51%、102.25%、94.97%、98.06%、93.89%，RSD 分別為0.85%、1.64%、1.84%、2.38%、2.33%、1.33%、1.75%、1.59%、2.88%。

2.4 樣品含量測定 取6 家企業120 批樣品，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果Tab.3 Results for content determination of various constituents

然后，以各成分平均含量為指標繪制雷達圖［6，9］，見圖2。由此可知，企業Q1、Q4、Q6 整體輪廓均較大，表明樣品中各成分平均含量較高，其中Q1 輪廓基本呈現一個類圓形，表明產品質量良好； Q3 輪廓明顯小于其他企業，表明產品可能存在質量較低的風險； Q5 輪廓呈現一個銳尖角形，阿魏酸含量較高，其余成分含量較低，并且該企業執行標準中收載了阿魏酸，雖然嚴格保證了該成分質量，但忽略了產品整體質量； 同一成分在不同企業樣品中的含量差異很大，例如Q4 樣品中羥基紅花黃色素A 含量是在Q3 樣品中的42 倍，阿魏酸含量僅是在Q5 樣品中的1/5。

圖2 各成分平均含量雷達圖Fig.2 Radar chart for average contents of various constituents

2.5 化學模式識別研究

2.5.1 熱圖聚類分析 以120 批樣品中各成分含量為指標，采用Heml-1.0 軟件，選擇歐式距離、遠鄰法進行熱圖聚類分析［10］，結果見圖3。其中，行代表各成分，列代表樣品，通過顏色冷暖（紅綠深淺） 來顯示各成分含量高低。

圖3 各成分含量熱圖聚類分析Fig.3 Heatmap clustering analysis of contents of various constituents

由此可知，企業Q1、Q4、Q6 整體條帶顏色偏暖，表明樣品中各成分含量較高； Q3 整體條帶顏色均偏冷，表明樣品中各成分含量較低，與圖2 一致； Q1、Q4 樣品基本各自聚類，而Q6 樣品分散于兩者分組中，表明其質量一致性較差； 除Q6外，其余企業樣品各自聚為一類，表明其各自質量一致性較好，但不同企業樣品質量一致性較差；C6 （阿魏酸） 聚為一類，其他成分聚為一類，表明阿魏酸是區分各樣品的主要成分［9］。

2.5.2 主成分分析 以各成分含量為變量，采用SIMCA 14.1 軟件對120 批樣品進行主成分分析［9，11-13］，發現貢獻率最大的2 個主成分累積貢獻率超過64%，可較好地體現膚癢顆粒基本特征和主要信息［14］。因此，本實驗以上述2 個主成分為坐標軸構建主成分平面，將多元變量通過降維方式投影在二維平面上，觀察樣品整體分布情況和各變量對樣品分布的貢獻［14］，結果見圖4～5。

圖4 主成分分析得分散點圖Fig.4 Score scatter plot for principal component analysis

圖5 主成分分析載荷圖Fig.5 Loading plot for principal component analysis

由此可知，企業Q1 ～Q5 分別出現明顯的分類，表明樣品質量一致性較好； Q6 分散在Q1、Q4中，表明其質量一致性較差，與圖3 一致； C6（阿魏酸） 離原點的距離最遠，表明它是不同企業樣品質量差異的重要指標［9］。

3 討論

課題組前期發現，不同企業提供的投料藥材紅花、川芎主要成分含量差異較大，并且工藝和參數存在較大差異。本實驗結果也表明，同一企業生產的不同批次樣品之間質量一致性較好，而不同企業生產的存在較大差異，這就需要有關部門強化監管意識，企業采用合格原料藥材并嚴格按照相關標準投料和生產，以期保證藥品質量［15］。

中藥藥效是多種成分的綜合效應，作用機制復雜［16］，故活性成分越多，含量越高，藥效可能越好。本實驗查閱文獻［17-21］ 發現，羥基紅花黃色素A 來源于紅花，阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A 均來源于川芎，新綠原酸、咖啡酸、綠原酸均來源于蒼耳子、川芎、白英，隱綠原酸來源于蒼耳子、白英。

4 結論

本實驗建立UHPLC 法同時測定6 家企業120批膚癢顆粒中新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A 的含量，覆蓋了方中80%的藥味，具有較強的代表性，并且采用雷達圖、熱圖聚類分析、主成分分析等化學模式識別手段，能較全面地反映該制劑整體質量情況，從而為其質量控制提供可行的技術參考和客觀數據。