穿心蓮內(nèi)酯自微乳給藥系統(tǒng)制備

王冰茜，陳 挺，魏 莉?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203； 2.上海智同醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203）

穿心蓮內(nèi)酯是從穿心蓮中提取得到的一種二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性［1-3］，其水溶性差，屬于BCS Ⅱ類成分。前期已有優(yōu)化穿心蓮內(nèi)酯自微乳給藥系統(tǒng)處方的報道，發(fā)現(xiàn)該劑型能有效提高原料藥溶解度［4-8］，其中油相大多為合成的中、長鏈甘油三酯類。近年來，有使用松香油［9］、葫蘆巴油［10］或薄荷素油［11］制備自乳化系統(tǒng)的研究，這些油相良好的親脂性使其能溶解BCS Ⅱ、Ⅳ類難溶藥物，同時它們還有著理想的生物活性，如抗菌、抗氧化等，在一定程度上減少了相關(guān)產(chǎn)品中其他抗氧劑的使用。

廣藿香油為廣藿香干燥地上部分經(jīng)水蒸氣蒸餾提取得到的揮發(fā)油，主要成分為廣藿香醇、廣藿香酮、廣藿香烯等［12］，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)胃腸道、抗氧化等藥理作用［13］。中醫(yī)臨床有應(yīng)用穿心蓮與廣藿香配伍治療腸系疾病，并且在葛香感冒膠囊、康樂鼻炎片等制劑中也有使用。本實驗以廣藿香油為油相制備穿心蓮內(nèi)酯自微乳給藥系統(tǒng)，發(fā)揮中藥揮發(fā)油“藥輔合一” 的雙重作用，以期獲得對該成分更好的增溶效果，從而提高其水溶性和生物利用度。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； ZS-90 型馬爾文激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）； IKA 磁力攪拌器［艾卡（廣州） 儀器設(shè)備有限公司］； 離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）； ZRS-8G 智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 穿心蓮內(nèi)酯對照品 （批號20210301，湖北慧擇普醫(yī)藥科技有限公司，純度96.12%）。廣藿香油（批號20200615，江西恒誠天然香料油有限公司）。油酸乙酯、中碳鏈脂肪酸甘油酯（MCT）、單辛酸丙二醇酯（CapryolTM90）、單亞油酸甘油酯（MasineTM35-1）、單油酸甘油酯（PeceolTM）、油酸聚乙二醇-6-甘油酯（Labrafil?M1944CS）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol?）、乙二醇單乙基醚（Transcutol? HP）均由法國嘉法獅公司捐贈； 聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor?RH40） （德國BASF 公司）； ?；悄懰徕c、雞蛋卵磷脂、馬來酸等緩沖鹽（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-水（40 ∶60）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長224 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯原料藥適量，置于20 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解定容，得到1 mg/mL 貯備液，吸取適量，甲醇依次稀釋至0.003 1、0.006 3、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 mg/mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝21 228 716X＋15 717 （r＝0.999 9），在0.003 1～0.200 0 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得穿心蓮內(nèi)酯峰面積RSD 分別為0.19%、0.18%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗 平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得穿心蓮內(nèi)酯峰面積RSD 為0.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗 在一定量空白自微乳中加入不同質(zhì)量濃度對照品溶液，甲醇制成低、中、高水平 （50%、100%、150%） 供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯平均加樣回收率分別為100.32%、99.43%、100.27%，RSD 分別為0.35%，0.94%、0.53%。

2.2 自微乳給藥系統(tǒng)輔料篩選

2.2.1 平衡溶解度測定 分別在油相、乳化劑、助乳化劑中加入過量穿心蓮內(nèi)酯，渦旋混勻，37 ℃、150 r/min 振蕩平衡72 h，精密量取適量至量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻后測定平衡溶解度，結(jié)果見表1。最終確定，以廣藿香油為油相，Labrasol ALF、Labrosol、Tween 80 為乳化劑，Transcutol HP 為助乳化劑。

表1 穿心蓮內(nèi)酯平衡溶解度測定結(jié)果（n＝3）Tab.1 Results for equilibrium solubility determination of andrographolide （n＝3）

2.2.2 油相與乳化劑配伍 將廣藿香油與不同乳化劑分別按1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5 比例攪拌混合均勻，（1） 取無相分離的混合物1 g，滴入100 倍量37 ℃水中，100 r/min 攪拌，觀察乳化情況，分級見表2； （2） 取形成的分散液適量，采用紫外分光光度計在600 nm 波長處測定透光率，結(jié)果見表3。

表2 自微乳制劑外觀評定分級Tab.2 Appearanceassessmentgradingofselfmicroemulsion formulations

表3 廣藿香油與不同乳化劑配伍Tab.3 Compatibilities of Pogostemon cablin oil with different emulsifiers

由此可知，平衡溶解度較高的乳化劑Labrasol ALF 所得分散液澄清度較差，而Tween 80、HS-15、RH 40 所得外觀形狀理想，但它們對穿心蓮內(nèi)酯的溶解能力均較差，而且Tween 80 在處方分散過程中具有凝膠化現(xiàn)象，乳化緩慢，性質(zhì)不穩(wěn)定，受體內(nèi)環(huán)境影響較大，重復(fù)性差。綜合考慮平衡溶解度與外觀澄清度，最終確定將Labrasol ALF 和Tween 80 聯(lián)合使用。

2.2.3 混合乳化劑配伍 Labrasol ALF 與Tween 80 分別按1 ∶4、1 ∶2、2 ∶3、1 ∶1、3 ∶2、2 ∶1、4 ∶1 比例混勻，再將廣藿香油與其分別按1 ∶9、2 ∶8、3 ∶ 7、4 ∶ 6、5 ∶ 5 比例攪拌混勻，按“2.1.2” 項下方法觀察乳化情況，測定透光率，并在納米粒度儀上測定粒徑和PDI，結(jié)果見表4。

表4 廣藿香油與混合乳化劑配伍Tab.4 Compatibilities of Pogostemon cablin oil with mixed emulsifiers

由此可知，當(dāng)油相占比40%時，ALF 與Tween 80 按2 ∶3～2 ∶1 比例配伍后透光率在80%左右，可明顯改善單用ALF 時分散液外觀性狀； 隨著油相占比增加，透光率和粒徑有先升后降的趨勢，推測其原因可能為廣藿香油是混合物，存在天然表面活性劑，可進(jìn)一步增強(qiáng)乳化效果。

2.2.4Km值篩選 采用直接加水滴定法繪制偽三元相圖，固定Labrasol ALF 與Tween 80 比例3 ∶2，將其與助乳化劑分別按Km值4 ∶1、2 ∶1、3 ∶2、1 ∶1、2 ∶3、1 ∶2、1 ∶4 混勻，再與廣藿香油分別按1 ∶9 ～9 ∶1 比例混合，邊攪拌邊連續(xù)加入37 ℃超純水，待溶液澄清透明或伴有藍(lán)色乳光時，準(zhǔn)確記錄溶液由澄清至渾濁或渾濁至澄清時突變點(diǎn)的加水量，采用Origin 軟件繪制偽三元相圖，計算陰影部分面積，結(jié)果見圖1。由此可知，成乳區(qū)域較大的Km值比例包括4 ∶1、3 ∶2，其中Km值為4 時乳化劑占比過大，容易引起較明顯的胃腸刺激性，故不考慮。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯自微乳給藥系統(tǒng)偽三元相圖Fig.1 Pseudo-ternary phase diagrams for andrographolide self-microemulsifying drug delivery system

2.3 處方優(yōu)化 以廣藿香油占比（A）、Labrasol ALF 與Tween 80 比例（B）、Km值（C） 為影響因素，平衡溶解度（Y，測定方法為在攪拌均勻的空白自微乳給藥系統(tǒng)中加入過量穿心蓮內(nèi)酯，渦旋混勻，超聲助溶后靜置12 h 平衡，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，甲醇稀釋后進(jìn)樣測定） 為評價指標(biāo)，星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化處方，因素水平見表5，結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法因素水平Tab.5 Factors and levels for central composite designresponse surface method

表6 星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果Tab.6 Design and results for central composite designresponse surface method

表7 方差分析結(jié)果Tab.7 Results for analysis of variance

采用Design-Expert 10.0.1 軟件對表6 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得方程為Y＝7.27－1.29A＋0.12B－2.03C＋0.097AB＋0.62AC＋0.63BC－ 0.32A2＋0.043B2＋0.80C2（R2＝0.958 9），相關(guān)系數(shù)大于0.9，模型P＜0.05，失擬項P＞0.05，表明該模型可用于預(yù)測分析。另外，表7 顯示油相占比和Km值有顯著影響（P＜0.05），Labrasol ALF 與Tween 80 比例無顯著影響（P＞0.05），其原因可能為最初聯(lián)合應(yīng)用這2 種乳化劑的目的是改善微乳液外觀，使其具有更好的澄清度與更快的乳化時間，而并非改善平衡溶解度。

響應(yīng)面分析見圖2，可知等高線AC、BC呈橢圓形，表明其交互作用顯著。以平衡溶解度為指標(biāo)，得最優(yōu)處方為廣藿香油、Labrasol ALF、Tween 80、Transcutol HP 占比10.45%、13.28%、9.82%、66.44%，平衡溶解度為11.540 9 mg/g。按上述優(yōu)化處方制備3 批樣品，測得平均平衡溶解度為（11.95±0.04） mg/g，與預(yù)測值11.540 9 mg/g 接近（相對偏差為3.5%），表明該模型穩(wěn)定可靠。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.4 質(zhì)量評價

2.4.1 粒徑、PDI、透光率測定 取3 批樣品，37 ℃純化水稀釋100 倍，測得其平均粒徑為（51.70±2.91） nm，PDI 為0.27±0.02，乳化時間為（20.22±0.38） s，透光率為（91.21±1.58）%。

2.4.2 稀釋倍數(shù)對粒徑的影響 取自微乳給藥系統(tǒng)適量，37 ℃純化水分別稀釋5、10、20、50、100、200、400 倍，測定其平均粒徑、PDI、透光率，并觀察其室溫放置12 h 后有無沉淀或相分離，結(jié)果見表8，可知在一定范圍內(nèi)隨著稀釋倍數(shù)增加，粒徑逐漸減小，均在100 nm 以內(nèi)，符合自微乳給藥系統(tǒng)要求。另外，人體空腹?fàn)顟B(tài)下胃中的平均液體量為45 mL，服用0.5 g 左右自微乳給藥系統(tǒng)時被稀釋100 倍左右，粒徑符合要求。

表8 稀釋倍數(shù)對粒徑的影響（n＝3）Tab.8 Effect of dilution times on particle size（n＝3）

2.4.3 分散介質(zhì)對粒徑的影響 分別以純化水、鹽酸（pH 1.2）、磷酸鹽緩沖液 （pH 5.5、6.8、7.2） 為分散介質(zhì)，將自微乳給藥系統(tǒng)稀釋100 倍，測定其粒徑、PDI，結(jié)果見表9。

表9 分散介質(zhì)對粒徑的影響（n＝3）Tab.9 Effect of dilution medium on particle size （n＝3）

2.4.4 凍融穩(wěn)定性考察 取自微乳給藥系統(tǒng)適量，在－20 ℃下冷凍24 h 后37 ℃水浴解凍24 h，反復(fù)3 次，純化水稀釋100 倍，測定其粒徑、PDI，結(jié)果見表10。由此可知，凍融循環(huán)后自微乳給藥系統(tǒng)粒徑增加，但仍符合要求。

表10 凍融穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝3）Tab.10 Results for freeze-thaw stability investigation（n＝3）

2.4.5 體外溶出研究 取自微乳給藥系統(tǒng)適量，按照2020 年版《中國藥典》 四部通則0931 第二法槳法，量取溶出介質(zhì)900 mL，設(shè)定溫度為（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，從接觸溶出介質(zhì)時開始計時，于5、10、20、30、45、60、90、120 min 各取10 mL，補(bǔ)充等溫等體積磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，結(jié)果見圖3。由此可知，自微乳給藥系統(tǒng)溶出速率明顯提高，5 min 內(nèi)即溶出完全，而原料藥2 h 內(nèi)累積溶出度仍低于60%。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯體外溶出曲線（n＝3）Fig.3 In vitro dissolution curves for andrographolide（n＝3）

2.5 動態(tài)溶解度研究

2.5.1 空腹?fàn)顟B(tài)模擬腸液制備 參考文獻(xiàn)［14-15］ 報道，配方為?；悄懰徕c3 mmol/L、雞蛋卵磷脂200 μmol/L、氯化鈉68.62 mmol/L、馬來酸19.12 mmol/L，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至6.5，即得。

2.5.2 測定方法 取過量穿心蓮內(nèi)酯原料藥，置于37 ℃空腹?fàn)顟B(tài)模擬腸液中，150 r/min 超聲分散均勻，于5、15、30、45、60、120、180、240、300、360 min 各取2.5 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液稀釋后進(jìn)樣分析，測定動態(tài)溶解度。取空白自微乳給藥系統(tǒng)適量，按1 ∶100 比例分散于37 ℃空腹?fàn)顟B(tài)模擬腸液中，150 r/min 攪拌均勻后加入過量原料藥，于5、15、30、45、60、120、180、240、300、360 min 各取2.5 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液稀釋后進(jìn)樣分析，測定動態(tài)溶解度。取相當(dāng)于平衡溶解度100%的自微乳給藥系統(tǒng)0.5 g，加到50 mL 37 ℃空腹?fàn)顟B(tài)模擬腸液中，150 r/min 攪拌均勻，于5、15、30、45、60、120、180、240、300、360 min 各取2.5 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液稀釋后進(jìn)樣分析，測定動態(tài)溶解度。將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad Prism 軟件，繪制時間-動態(tài)溶解度曲線，見圖4。由此可知，上述3種樣品溶解度分別為 0.047、0.062、0.119 mg/mL，表明自微乳給藥系統(tǒng)可明顯提高原料藥在空腹?fàn)顟B(tài)模擬腸液中的溶解度，并且能在6 h內(nèi)維持相對穩(wěn)定的1.92 倍過飽和度。

圖4 穿心蓮內(nèi)酯時間-動態(tài)溶解度曲線（n＝3）Fig.4 Time-dynamicsolubilitycurvesfor andrographolide （n＝3）

3 討論

本實驗根據(jù)穿心蓮內(nèi)酯在輔料中的平衡溶解度篩選增溶效果良好的輔料，以粒徑、透光率等指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗以獲得乳化能力更佳的輔料，在確保能形成自乳化體系、制劑外觀理想的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化處方，并進(jìn)行質(zhì)量評價。結(jié)果，所制備的穿心蓮內(nèi)酯自微乳給藥系統(tǒng)平衡溶解度較文獻(xiàn)［16-17］ 報道的提高2 倍左右，但由于大多數(shù)自微乳最終劑型為軟膠囊，故該制劑平衡溶解度尚未達(dá)到臨床常用單劑量需求（50 mg/粒），其原因可能為（1） 穿心蓮內(nèi)酯在油相、乳化劑（或助乳化劑） 中溶解度差異很大，導(dǎo)致開發(fā)高劑量的自乳化制劑非常困難； （2） 穿心蓮內(nèi)酯在不同pH 緩沖液飽和正丁醇中的LogP為1.5 左右（文獻(xiàn)［4，18］ 報道為1.55 ～2.63），LogP在0 ～3 范圍內(nèi)親脂性適中，而廣藿香油主要成分廣藿香醇為4.7 左右，即兩者脂溶性有所差異。

另外，過飽和藥物遞送系統(tǒng)屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)，沉降（析出） 是其生物藥劑學(xué)性質(zhì)的潛在不利因素［19］。本實驗探索了在100%載藥情況下自微乳給藥系統(tǒng)中穿心蓮內(nèi)酯溶解度，發(fā)現(xiàn)它能在6 h內(nèi)維持該載藥下的過飽和度。