六味地黃丸介導RAGE 抑制MMP-2/MMP-9 對Aβ1－40 損傷bEnd.3 細胞緊密連接蛋白的影響

丁 蕊，袁 永，賈亞泉，高愛社，張振強，宋軍營?

（1.河南中醫藥大學中醫藥科學院，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫藥大學醫學院，河南 鄭州 450046；3.河南省神經退行性疾病防治工程研究中心，河南 鄭州 450046）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） 是一種進行性發展的神經退行性疾病，其病理發生除β 淀粉樣蛋白（β-Amyloid protein，Aβ） 沉積形成的老年斑外，還與血腦屏障功能障礙相關［1-2］。血腦屏障是防止外周循環有害物質進入腦內的重要組織結構［3］，由腦微血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞、基底膜、神經元、小膠質細胞組成。其核心是腦微血管內皮細胞間的緊密連接，表達于血管內皮細胞表面的閉鎖小帶蛋白1 （Zonula occluden-1，ZO-1） 是主要結構［4-5］。基底膜的細胞外基質蛋白能夠被基質金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs） 降解［6］，尤其是MMP-2和MMP-9 可以消化內皮基底層和緊密連接支架蛋白，破壞血腦屏障完整性［7］。

此外，外周組織和器官產生的Aβ 不能及時轉運清除，經血腦屏障進入腦內大量堆積，推動AD發展［8］。Aβ 跨血腦屏障的轉運與低密度脂蛋白相關蛋白1 （low-density lipoprotein receptor related protein1，LRP1） 和晚期糖基化終末產物受體（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）有關。課題組前期研究表明，六味地黃丸可能是通過RAGE/LRP1 改善AD 小鼠腦微血管損傷［9］，本研究采用Aβ1－40損傷小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3［10］作為AD 細胞模型，以RAGE 為靶點，探討六味地黃丸含藥血清對神經血管單元和血腦屏障的影響及其防治AD 是否與調控RAGE 表達相關，為中醫理論“腎精虧虛” 即“腎精不足不能充養腦髓，致神機失用，最后發展為癡呆［11］” 提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物與細胞 SPF 級雄性昆明小鼠，12 周齡，體質量30～35 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （魯）20190003，合格證編號370726211100788147］，飼養于河南中醫藥大學實驗動物中心［實驗動物使用許可證號SYXK （豫） 2021-0015］，動物實驗經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核通過（倫理號DWLL202109007）。小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3 （編號BNCC339490），購自河北北納生物科技有限公司。

1.2 藥物 六味地黃丸（仲景宛西制藥股份有限公司，批號210105）； Aβ1－40（上海源葉生物科技有限公司，批號D08GS170718）； RAGE 抑制劑FPS-ZM1 （美國MCE 公司，貨號945714-67-0）。

1.3 試劑 胎牛血清（蘇州雙洳生物科技有限公司，批號QA01563）； DMEM 高糖培養基、BCA 試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司，批號20220507、20210406、20200826、20211129、20211010）； 增強型細胞增殖毒性檢測（CCK-8） 試劑（上海翊圣生物科技有限公司，批號C8102040）； LRP1 抗體（美國Santa Cruz 公司，貨號2703-1）； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH） 抗體（上海泊灣生物科技有限公司，批號F057302）； BDNF 抗體（武漢三鷹生物科技有限公司，批號10003458）； RAGE、MMP-2、MMP-9、ZO-1、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔多克隆抗體、HRP 標記的山羊抗小鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號10CM57、11CM341、ZP2807BP07、ZP1007BP07、BST15J22C15K55、BST16K30C16L50）。

1.4 儀器 Multiskan GO 型多功能全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； Microfuge ?20R 型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）； JY200C 型電泳儀、Mini-Protean 型蛋白轉印系統（美國Bio-Rad 公司）； DFC450C 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 六味地黃丸含藥血清（MSLDP） 制備 昆明小鼠適應性飼養1 周后，分為給藥組和對照組。六味地黃丸濃縮丸溶于生理鹽水制備混懸液。根據課題組前期研究結果，給藥組以2.7 g/kg 劑量灌胃，對照組以等體積生理鹽水灌胃，每天2 次，連續3 d。第4 天給藥1 h 后，摘眼球取血。全血室溫下靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，取血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm 無菌濾器過濾除菌，分裝后于－80 ℃保存備用。

2.2 Aβ1－40和FPS-ZM1 配制 Aβ1－40用無菌超純水配制，于5% CO2培養箱中37 ℃孵育7 d，待其變為凝膠狀態后取出并分裝于無菌EP 管內，終濃度為1 154.78 μmol/L； FPS-ZM1 是一種高親和且無細胞毒性的RAGE 抑制劑，本實驗選用濃度為1 μmol/L。2 種試劑均置于－20 ℃冰箱保存。

2.3 細胞培養 bEnd.3 細胞使用含10% FBS、90% DMEM 高糖培養基在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待細胞生長至合適密度時換液或接種于96、24、6 孔板細胞培養板，以便后續實驗。

2.4 分組及給藥 為了明確MSLDP 對Aβ1－40損傷的bEnd.3 細胞緊密連接的影響，將細胞分為對照組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋MSLDP 組、MSLDP 組。為進一步探討MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞RAGE/MMP-2/MMP-9 的調控作用，將細胞分為對照組、Aβ1－40組、FPS-ZM1 ＋Aβ1－40組和FPS-ZM1 ＋Aβ1－40＋MSLDP 組。

2.5 CCK8 檢測細胞存活率 細胞以每孔1×105個的密度接種到96 孔板上，培養至完全貼壁生長后，按“2.4” 項下分組給藥處理后培養24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在培養箱避光孵育1 h，用多功能酶標儀測定每組細胞在450 nm 波長下的吸光度，計算細胞存活率。

2.6 免疫熒光檢測細胞LRP1、RAGE、ZO-1 的熒光強度 在顯微鏡下觀察細胞狀態后棄舊培養基，用1×PBS 洗2 次，每次3 min； 每孔加入4%多聚甲醛200 μL，室溫培養1 h； 除去多聚甲醛，1×PBS 洗3 次，每次3 min； 每孔加入7% 山羊血清200 μL，室溫封閉2 h； 棄封閉液，加入1×PBS 稀釋的一抗LRP1 （1 ∶200）、RAGE （1 ∶200）、ZO-1 （1 ∶200），每孔100 μL，4 ℃孵育過夜； 回收一抗，1×PBS 洗3 次，每次3 min，每孔加入熒光二抗100 μL （1 ∶500），室溫孵育1 h，避光操作；棄去二抗，1×PBS 洗3 次，每次3 min； 每孔加入DAPI 溶液50 μL 染核，避光孵育3 min，1×PBS 洗4 次，每次5 min。從24 孔板中取出爬片蓋于加含2 μL 抗熒光淬滅劑的載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.7 Western blot 法檢測細胞 LRP1、RAGE、MMP9、MMP-2、ZO-1、BDNF 蛋白表達 收集細胞蛋白，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度加入5×上樣緩沖液，95 ℃變性10 min，冷卻后上樣，凝膠電泳后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF） 上； 用TBST 配制的5%脫脂奶常溫搖床封閉2 h； 加入稀釋好的一抗LRP1、RAGE、MMP-9、MMP-2、ZO-1、BDNF （1 ∶1 000） 4 ℃冰箱孵育過夜； 使用TBST 搖洗3 次后加入相應的二抗（1 ∶10 000） 室溫搖床孵育1 h，再用TBST搖洗3 次； 使用ECL 顯影液顯影，使用Image J 圖像分析軟件進行定量分析。

2.8 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 Aβ1－40對bEnd.3 細胞活性的影響 如圖1 所示，與空白組（0 μmol/L） 比較，隨著Aβ1－40濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，呈現劑量依賴性（P＜0.01）。結合前期研究基礎，選擇10 μmol/L Aβ1－40為合適的造模濃度。

圖1 Aβ1－40對bEnd.3 細胞活性的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effects of Aβ1－40 on the viability of bEnd.3 cells（±s，n＝6）

3.2 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞活性的影響 如圖2 所示，與對照組比較，Aβ1－40組細胞存活率降低（P＜0.01）； 與Aβ1－40組比較，隨MSLDP濃度增加細胞存活率升高（P＜0.05，P＜0.01）。MSLDP 濃度為12%時，細胞存活率不再升高，故選擇10%作為MSLDP 最佳作用濃度。

圖2 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞活性的影響（±s，n＝6）Fig.2 Effects of MSLDP on the viability of bEnd.3 cells injured by Aβ1－40 （±s，n＝6）

3.3 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞LRP1、RAGE 蛋白表達的影響 Western blot 結果如圖3 所示，與對照組比較，Aβ1－40組LRP1 蛋白表達降低（P＜0.05），RAGE 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與Aβ1－40組比較，MSLDP 組和MSLDP＋Aβ1－40組LRP1蛋白表達均升高（P＜0.05），RAGE 蛋白表達均降低（P＜0.05）。免疫熒光定位如圖4 所示，與對照組比較，Aβ1－40組LRP1 熒光強度降低（P＜0.01），RAGE 熒光強度增強（P＜0.01）； 與Aβ1－40組比較，MSLDP 組和MSLDP ＋Aβ1－40組LRP1 熒光表達均增強（P＜0.05，P＜0.01），RAGE 熒光強度均減弱（P＜0.01），與Western blot 結果相一致。

圖3 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞LRP1 和RAGE 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.3 Effects of MSLDP on the protein expressions of LRP1 and RAGE in bEnd.3 cells injured by Aβ1-40 （±s，n＝3）

圖4 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞LRP1、RAGE 熒光表達的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of MSLDP on the fluorescence expressions of LRP1 and RAGE in bEnd.3 cells injured by Aβ1－40 （±s，n＝3）

3.4 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞MMP-2、MMP-9、ZO-1、BDNF 蛋白表達的影響 如圖5 所示，與對照組比較，Aβ1－40組細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達升高（P＜0.01），ZO-1、BDNF 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與Aβ1－40組比較，MSLDP 組和MSLDP＋Aβ1－40組細胞MMP-2、MMP-9 蛋白表達均降低（P＜0.01），ZO-1、BDNF 蛋白表達均升高（P＜0.01）。

圖5 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞MMP-2、MMP-9、ZO-1、BDNF 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.5 Effects of MSLDP on the protein expressions of MMP-2，MMP-9，ZO-1 and BDNF in bEnd.3 cells injured by Aβ1－40 （±s，n＝3）

3.5 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞ZO-1 熒光表達的影響 如圖6 所示，與對照組比較，Aβ1－40組ZO-1 熒光強度減弱（P＜0.01）； 與Aβ1－40組比較，MSLDP 組和MSLDP ＋Aβ1－40組細胞ZO-1 熒光表達均增強（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 MSLDP 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞ZO-1 熒光表達的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of MSLDP on the fluorescence expression of ZO-1 in bEnd.3 cells damaged by Aβ1－40 （±s，n＝3）

3.6 MSLDP 及FPS-ZM1 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞RAGE、MMP-2、MMP-9、ZO-1 蛋白表達的影響 如圖7 所示，與對照組比較，Aβ1－40組細胞MMP2、MMP-9、RAGE 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），ZO-1 蛋白表達降低 （P＜0.05）； 與Aβ1－40組比較，Aβ1－40＋FPS-ZM1 組和Aβ1－40＋FPSZM1＋MSLDP 組細胞MMP-2、MMP9、RAGE 蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），ZO-1 蛋白表達均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 MSLDP 及FPS-ZM1 對Aβ1－40損傷bEnd.3 細胞RAGE、MMP-2、MMP-9、ZO-1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.7 Effects of MSLDP and FPS-ZM1 on the protein expressions of RAGE，MMP-2，MMP-9 and ZO-1 in bEnd.3 cells injured by Aβ1－40 （±s，n＝3）

4 討論

中醫并無AD 這一病名的記載，但關于AD 相關癥狀記載于中醫“癡呆” “善忘” “健忘” 等中。張錫純在《醫學衷中參西錄》［12］中提出： “人之腦髓空，……甚或突然昏厥，知覺運動俱廢。”AD 發生的原因主要是由于髓海不足。腎主骨生髓，可見補腎對治療AD 的重要意義。六味地黃丸是經典補腎方劑之一，網絡藥理學研究表明六味地黃丸可通過多靶點、多途徑發揮治療AD 的作用［13］。課題組前期研究發現六味地黃丸能夠保護神經細胞，對VEGF 調節的作用可能與腦微血管內皮功能有關［14］，同時也發現六味地黃丸能夠調節RAGE/LRP1 受體系統影響Aβ 代謝，改善SAMP8小鼠的腦微血管損傷［9］，本次實驗進一步深入研究其作用機制。

血腦屏障是大腦與外周循環系統的一道重要生理性的屏障，阻止外周有害物質進入腦內，保護腦內部環境的穩定。研究表明，Aβ 毒性作用介導了血腦屏障結構破壞，并致使其通透性增加［15］； 而通透性增加又會促進外周Aβ 更容易透過血腦屏障進入腦內，造成AD 病程的惡性循環［16-18］。血腦屏障通透性增加也與MMPs 相關，尤其是MMP-2 和MMP-9［19］。有研究表明AD 模型小鼠海馬內MMPs表達明顯增多，MMPs 可以降解毛細血管基底膜蛋白從而破壞血腦屏障，增加其通透性［20］。本研究發現，Aβ1－40作用于bEnd.3 細胞后，細胞活性降低，RAGE 表達升高，LRP1 表達降低，這可能導致Aβ 轉運失調，在細胞內過度累積，進而加重細胞毒性。同時本研究還發現，Aβ1－40作用于bEnd.3 細胞后，MMP-2、MMP-9 蛋白表達升高，ZO-1表達降低，進一步說明了Aβ 誘導的MMPs 通過破壞細胞緊密連接，損害血腦屏障功能，增加其通透性。MSLDP 作用后，細胞活性增加，RAGE、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達下調，LRP1 和ZO-1 表達上調，說明六味地黃丸能夠抑制Aβ 的向內轉運，增加了對腦微血管內皮細胞的保護作用。BDNF 是體內含量最多的神經營養因子，可保護神經元免受Aβ 集沉積所致的神經毒性損傷［21］。本研究發現，Aβ1－40抑制BDNF 的表達，而六味地黃丸能夠增加其表達，進一步說明了六味地黃丸具有保護神經元的作用。

進一步探討MSLDP 的調控作用是否以RAGE為靶點，采用了RAGE 特異性抑制劑進行研究，發現RAGE 抑制劑可以改善Aβ1－40引起的ZO-1、MMP-2、MMP-9 改變，說明RAGE 在損害AD 血腦屏障中起重要作用。且RAGE 抑制劑與MSLDP 聯用對ZO-1、MMP-2、MMP-9 表達調控更為明顯，因此推斷MSLDP 對Aβ1－40損傷的AD 細胞模型的保護作用與調控RAGE 途徑密切相關。這說明了六味地黃丸能夠通過RAGE 途徑調節MMP-2/MMP-9 改善內皮細胞連接和血腦屏障，發揮防治AD 的作用。但RAGE 在AD 中還有其他作用機制，如其與NF-κB 相互作用的炎癥機制、與配體的相互作用途徑等，需要進一步深入研究，為六味地黃丸調控RAGE 途徑防治AD 提供更多的實驗依據。