科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞的保護作用

賈 享，賀武斌，楊秋實，黃建華

（錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000）

阿霉素是臨床上常見的蒽環類抗腫瘤藥物［1］，具有較高的心肌親和力，其頻繁的使用及劑量的累積常導致腫瘤患者出現不同程度的心肌損傷［2］。目前關于阿霉素心肌損傷的作用機制仍不清楚，普遍認為其主要機制是氧化應激，氧化應激本質是抗氧化劑的消耗或活性氧（ROS） 的積累導致氧化和抗氧化系統失衡［3］。其中大量研究表明，過量ROS 產生可以導致DNA、蛋白質和脂質的損傷引起細胞的死亡，如凋亡［4］、自噬［5］、焦亡［6］及鐵死亡［7］。因此積極尋找并開發藥物對阿霉素心肌損傷的治療具有重大意義。隨著中醫藥現代化不斷發展，大量中藥及其單體在不同疾病領域發揮的藥理作用備受關注，是當前研究的熱點。

科羅索酸是從山楂果、枇杷葉或者大花薔薇中提取的一種五環三萜類化合物［8］，具有廣泛的藥理活性，包括降糖［9］、抗炎［10］、抗腫瘤［11］及保護心血管［12］。姜華等［13］發現，科羅索酸可以提高糖尿病大鼠心肌細胞抗氧化應激能力來降低心臟損傷。Li 等［14］報道，科羅索酸以AMPK 依賴性方式調節Drp1 磷酸化增強內皮細胞抗氧化應激能力，改善受損線粒體功能。由于科羅索酸在阿霉素心肌損傷中的作用研究較少，因此本研究通過建立阿霉素心肌細胞損傷模型，探索科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 科羅索酸（純度＞98%，批號JZ21031721） 購自南京景竹生物科技有限公司。Nrf2 抑制劑 （ ML385，純度≥99%，批號L17D9L77422）、右丙亞胺 （dexrazoxane，DEX，純度≥98%，批號H21M9Z61735） 均購自上海源葉生物科技有限公司； 阿霉素（批號A1832） 購自美國APExBIO 公司； MTT （批號M6180） 購自北京博奧拓達科技有限公司； 胎牛血清（FBS，批號JC63441） 購自美國CLARK Bioscience 公司；DMEM/HIGH GLUCOSE 培 養 基 （ 批 號AG29643090） 購自美國HyClone 公司； Hoechst 33342 試劑盒（批號072221220411）、活性氧檢測試劑盒（批號061521210723）、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（批號021921210630）、ECL 化學發光試劑盒（批號05202121210715） 均購自上海碧云天生物技術有限公司； 鐵離子檢測試劑盒（批號2021O0HE1042） 購自北京普利萊基因技術有限公司； 抗體Bax （批號M09231637）、抗體Bcl-2 （批號H09301556）、抗體cleaved Caspase 3（批號M04142117）、抗體Nrf2 （批號I02212135）均購自沈陽萬類生物科技有限公司； β-actin （批號AC21111012A） 購自武漢賽維爾生物科技有限公司； 抗體Ptgs2 （批號86f4760）、抗體GPX4 （批號78p5366） 均購自美國Affinity 公司； 山羊抗兔IgG HRP （批號22181594） 購自合肥白鯊生物科技有限公司。

1.2 細胞培養 大鼠H9c2 心肌細胞由錦州醫科大學附屬第一醫院外科學重點實驗室贈予。用含10% FBS、1%雙抗的DMEM 高糖培養基培養H9c2心肌細胞，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中，1 ～2 d換液1 次，待細胞密度為90%時傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞分組 細胞分為空白組、模型組 （1 μmol/L 阿霉素）、陽性組（1 μmol/L 阿霉素＋20 μmol/L DEX）、科羅索酸組（1 μmol/L 阿霉素＋5 μmol/L 科羅索酸） 及Nrf2 抑制劑組（1 μmol/L 阿霉素＋5 μmol/L 科羅索酸＋20 μmol/L ML385）。

1.4 MTT 法檢測細胞活性 制備密度6×104/mL的H9c2 心肌細胞懸液，以100 μL/孔接種于96 孔培養板中，每組設置6 個復孔。①檢測不同濃度科羅索酸 （0、0.5、1、5、10、20、50、80、100 μmol/L） 對H9c2 心肌細胞毒性； ②檢測不同濃度科羅索酸 （0、0.5、1、5、10、20、50 μmol/L）及DEX （20 μmol/L） 分別與阿霉素（1 μmol/L）共同處理H9c2 心肌細胞的存活率。按分組處理24 h后加入20 μL/孔MTT 液（5 mg/mL），置于37 ℃培養箱培養4 h 后，棄去上層液體，再加入150 μL/孔DMSO，于搖床充分振蕩溶解紫色結晶，用酶標儀在490 nm 波長處測量光密度（OD） 值。計算細胞增殖率，公式為細胞增殖率＝ （給藥組OD 值/對照組OD 值） ×100%，實驗重復3 次。

1.5 Hoechst 33342 染色檢測細胞凋亡 按“1.2”“1.3” 項下條件處理并收集細胞，每孔加入1 mL 10 mg/L Hoechst 33342 染液，放入培養箱中繼續培養20～30 min，棄去染液，PBS 洗滌3 次，用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照，實驗重復3 次。

1.6 ROS 試劑盒檢測活性氧水平 按 “1.2”“1.3” 項下條件處理并收集細胞，PBS 洗滌1 次，每孔加入1 mL 10 μmol/L DCFH-DA 熒光探針的無血清培養基，放入培養箱孵育，20 min 后棄去染液，PBS 洗滌3 次，用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照，實驗重復3 次。

1.7 鐵離子比色法檢測細胞Fe2＋水平 按“1.2”“1.3” 項下條件處理并收集細胞，加入裂解液置于搖床裂解2 h 后收集不同分組標本。按照鐵離子比色法檢測試劑盒說明書操作，將裂解的樣品與混液A 混勻，60 ℃孵育1 h，冷卻至室溫后加入鐵離子檢測試劑，常溫孵育30 min，在550 nm 波長處測定OD 值，根據標準曲線計算鐵離子濃度，實驗重復3 次。

1.8 Annexin V/PI 法檢測細胞凋亡率 按“1.2”“1.3” 項下條件處理并收集細胞，用不含EDTA的0.25%胰酶進行消化，離心收集細胞，用500 μL Annexin V 結合液重懸細胞后，依次加入Annexin V-FITC 染液5 μL 和PI 染液10 μL，2 ～8 ℃避光孵育15 min，最后用流式細胞儀上機分析細胞凋亡率，實驗重復3 次。

1.9 Western blot 法檢測Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2、Nrf2、GPX4 及Ptgs2 蛋白表達 按“1.2”“1.3” 項下條件處理并收集細胞，裂解細胞后，提取上層蛋白溶液進行BCA 定量，電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF 膜上，用2% BSA 封閉2 h，孵育一抗（1 ∶1 000）、二抗（1 ∶1 000），ECL 發光液顯影，實驗重復3 次，應用Image J 軟件進行灰度分析。

1.10 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 科羅索酸對H9c2 心肌細胞活力的影響 與空白組比較，0.5 ～10 μmol/L 科羅索酸對H9c2 心肌細胞活力沒有影響（P＞0.05），20 ～100 μmol/L科羅索酸呈濃度依賴性降低H9c2 心肌細胞活力（P＜0.01），見圖1。

圖1 科羅索酸對H9c2 心肌細胞活力的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effects of corosolic acid on the viability of H9c2 cardiomyocytes （±s，n＝6）

2.2 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞活力的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞活力降低（P＜0.01）； 與模型組比較，0.5 μmol/L科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞活力無明顯影響（P＞0.05），陽性組及1 ～10 μmol/L 科羅索酸能提高阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞活力（P＜0.01），見圖2。

圖2 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞活力的影響（±s，n＝6）Fig.2 Effects of corosolic acid on the viability of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝6）

2.3 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞凋亡的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞數量減少，細胞核呈現致密濃染及亮藍色熒光，細胞凋亡率升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組及科羅索酸各劑量組H9c2 心肌細胞數量增多，細胞核呈現致密濃染數量減少及亮藍色熒光降低，細胞凋亡率降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig.3 Effects of corosolic acid on the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.4 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞ROS 水平的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞產生大量ROS 并呈現強綠色熒光 （P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組及科羅索酸各劑量組H9c2 心肌細胞ROS 水平降低并呈現暗綠色熒光（P＜0.01），見圖4。

圖4 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞ROS 水平的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of corosolic acid on the ROS level of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.5 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞Fe2＋水平的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞Fe2＋水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性組及科羅索酸各劑量組H9c2 心肌細胞Fe2＋水平降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞Fe2＋水平的影響（±s，n＝3）Fig.5 Effects of corosolic acid on the Fe2＋level of H9c2 cardiomyocytesafterdoxorubicin induction （±s，n＝3）

2.6 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞凋亡率的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞凋亡率升高（P＜0.01）； 與模型組比較，科羅索酸組H9c2 心肌細胞凋亡率降低（P＜0.01），見圖6。

圖6 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞凋亡率的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of corosolic acid on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.7 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.01），Bax 及cleaved-caspase3 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，科羅索酸組H9c2 心肌細胞Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0.01），Bax 及cleaved-caspase3 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖7。

圖7 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞Bax、Bcl-2 及cleaved-caspase3 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.7 Effects of corosolic acid on the protein expressions of Bax，Bcl-2 and cleaved-caspase3 in H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.8 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞Nrf2、GPX4 及Ptgs2 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞GPX4 及Nrf2 蛋白表達降低 （P＜0.01），Ptgs2 蛋白表達升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，科羅索酸組H9c2 心肌細胞GPX4 及Nrf2 蛋白表達升高（P＜0.01），Ptgs2蛋白表達降低（P＜0.01），見圖8。

圖8 科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞Nrf2、GPX4 及Ptgs2 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.8 Effects of corosolic acid on the protein expressions of Nrf2，GPX4 and Ptgs2 in H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.9 Nrf2 抑制劑聯合科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞GPX4 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組H9c2 心肌細胞GPX4 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，科羅索酸組H9c2 心肌細胞GPX4 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與科羅索酸組比較，Nrf2 抑制劑組H9c2 心肌細胞GPX4 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖9。

圖9 Nrf2 抑制劑聯合科羅索酸對阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞GPX4 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.9 Effects of Nrf2 inhibitor combined with corosolic acid on the protein expression of GPX4 in H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

3 討論

阿霉素是常見的化療藥物，但對心臟具有毒性。當心肌細胞受到阿霉素刺激后，會產生ROS導致心功能障礙。ROS 主要是由線粒體產生，是有氧代謝過程中產生的副產物，在線粒體代謝和維持穩態平衡中發揮重要作用［15］。ROS 可以導致細胞凋亡。在細胞凋亡的調節中Bcl-2 家族的蛋白質起關鍵作用，Bax 是Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，細胞受到損傷時，Bax 從胞質轉位到線粒體表面，增加線粒體通透性，導致細胞色素C 外漏，活化下游的casepase3，激活線粒體細胞凋亡途徑［16］。Chu 等［17］發現FGF1 可以通過抑制ROS，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，降低Bax 及caspase3 蛋白表達，抑制H2O2誘導的H9c2 心肌細胞凋亡，在阿霉素心肌損傷中同樣發揮重要角色。Sirangelo 等［18］研究結果顯示，Hydroxytyrosol 能夠通過作用于SOD2 水平和氧化反應以及Bcl-2/Bax 介導的凋亡機制來抵消阿霉素誘導的心肌細胞毒性。本研究發現，采用1 μmol/L 阿霉素處理24 h 后，H9c2 心肌細胞內ROS 水平升高，細胞活力降低，凋亡率升高，凋亡蛋白Bax 及cleaved-caspase3 表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低。加入科羅索酸干預后，能提高H9c2 心肌細胞活力，降低H9c2 心肌細胞凋亡率及ROS 水平，降低凋亡蛋白Bax 及cleavedcaspase3 表達，升高抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，表明科羅索酸能夠通過降低ROS 抑制阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞凋亡。

同樣ROS 也能導致細胞鐵死亡。鐵死亡是一種新的細胞死亡方式，其本質是鐵累積和脂質過氧化產生［19］。ROS 在脂質過氧化中起關鍵作用，細胞內ROS 水平的改變可誘發細胞鐵死亡的發生。抗氧化系統的相關蛋白Nrf2、GPX4 及脂質過氧化相關蛋白Ptgs2 都是鐵死亡的標志性蛋白。Nrf2 是細胞內源性抗氧化分子，是一種重要的轉錄因子。在正常生理條件下，Nrf2 在細胞質中與Keap1 結合，然后Nrf2 被泛素-蛋白酶體系統降解。在氧化應激的情況下，Nrf2 從Keap1 解離并轉移到細胞核，調控GPX4 及Ptgs2 等下游基因的轉錄發揮抗氧化作用抑制鐵死亡［20］。Wang 等［21］研究發現，硫化氫可以激活Nrf2/GPX4 通路抑制鐵死亡來減輕顆粒物引起的肺氣腫和氣道炎癥。Lu 等［22］研究結果顯示，丙泊酚通過激活Nrf2/GPX4 信號通路抑制鐵死亡，增加細胞活力并抑制H9c2 心肌細胞的凋亡、氧化應激和炎癥反應減輕阿霉素心肌細胞損傷。本研究發現，科羅索酸能夠抑制Fe2＋水平，增強Nrf2 及GPX4 蛋白表達，抑制Ptgs2 蛋白，進而抑制阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞鐵死亡。為了驗證科羅索酸是否作用于Nrf2 通路，通過加入ML385 抑制劑后，發現GPX4 蛋白表達被抑制，由此推測Nrf2 可能是科羅索酸的作用靶點。

綜上所述，科羅索酸能抑制阿霉素誘導的H9c2 心肌細胞ROS 水平及細胞凋亡，并可能通過激活Nrf2/GPX4 通路抑制細胞鐵死亡。