植物源養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的促進(jìn)功能及機(jī)制研究

王蘇華，邢光偉，李 芳，周 結(jié)，張 宇，張 冉，董麗華，肖 釗，朱薛羽，王 強(qiáng)，陸榮柱

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生檢驗(yàn)系，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

脫發(fā)是一種頭發(fā)自行脫落的現(xiàn)象，但病理性的脫發(fā)則是指頭發(fā)過度脫落或者異常脫落，可表現(xiàn)為斑禿、雄激素性脫發(fā)、內(nèi)分泌生理性脫發(fā)、內(nèi)分泌異常脫發(fā)等多種類型。目前，脫發(fā)已成為臨床皮膚科高發(fā)疾病之一，其中以雄激素性脫發(fā)患病率最高，我國(guó)男性患病率約為21.3%，女性患病率約為6.0%［1-2］。雄激素性脫發(fā)嚴(yán)重影響患者的心理健康和生活質(zhì)量，需要盡早預(yù)防和診治。用于預(yù)防或治療毛發(fā)脫落和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的藥物有米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺等，但均具有較多的不良反應(yīng)和副作用［3-4］。開發(fā)有效、安全的含中藥成分的洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品則備受市場(chǎng)重視［5-6］。

詩碧曼養(yǎng)發(fā)精華液為一種外用生發(fā)劑，由何首烏、當(dāng)歸、蘆薈和人參等植物提取物制成，其相關(guān)成分具有補(bǔ)腎益血、養(yǎng)發(fā)潤(rùn)發(fā)和改善毛囊生長(zhǎng)微環(huán)境等多種功效，現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)養(yǎng)發(fā)精華液具有抗氧化及抗衰老的能力［7］。盡管中醫(yī)藥防治脫發(fā)的作用有所報(bào)道，但防治脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的機(jī)制仍未明了，本實(shí)驗(yàn)采用脫毛膏法脫毛小鼠模型和丙酸睪酮法雄激素性脫毛小鼠模型［8］，綜合評(píng)價(jià)植物源養(yǎng)發(fā)精華液促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 丙酸睪酮（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)1508221）； 血清睪酮（T）、5-二氫睪酮（DHT）、雌二醇（E2） 試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180302、20180302、20180302）； β-catenin 兔抗鼠單克隆抗體、GSK-3β 兔抗鼠單克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）。露蘭姬娜脫毛膏 （廣州市有喜化妝品有限公司，批號(hào)G20161229）； 米諾地爾噴霧劑（山東京衛(wèi)制藥有限公司，批號(hào)H20110149）； 詩碧曼養(yǎng)發(fā)精華液（以下簡(jiǎn)稱養(yǎng)發(fā)精華液） （連云港詩碧曼生物科技有限公司，批號(hào)20191115Y）。

1.2 動(dòng)物 115 只SPF 級(jí)健康且毛發(fā)正常的8 ～9 周齡C57BL/6J 小鼠，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （蘇） 2018-0008］。其中8周齡雄性C57BL/6J 小鼠65 只，用于建立對(duì)脫毛膏法脫毛小鼠模型及后續(xù)毛發(fā)生長(zhǎng)的研究； 9 周齡雄性C57BL/6J 小鼠50 只，用于建立雄激素性脫毛小鼠模型及后續(xù)毛發(fā)生長(zhǎng)的研究。所有實(shí)驗(yàn)均按照江蘇大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)原則和有關(guān)規(guī)定在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障系統(tǒng)中進(jìn)行（倫理號(hào)UJSIACUC-2020052101）。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±3）℃，相對(duì)濕度40% ～70%，12 h/12 h 光/暗循環(huán)，小鼠可以自由活動(dòng)、飲水和進(jìn)食。

2 方法

2.1 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏法脫發(fā)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響 使用電動(dòng)理發(fā)器及脫毛膏除去小鼠后背約2 cm×3 cm 的毛發(fā)，建立脫毛膏法脫毛小鼠模型。脫毛小鼠隨機(jī)分為空白組（75%乙醇，200 μL）、養(yǎng)發(fā)精華液低、中、高劑量組（養(yǎng)發(fā)精華液，50、100、200 μL） 和陽性對(duì)照組（5%米諾地爾，200 μL），每組12 ～14 只。分別用上述溶液涂抹脫毛區(qū)，每天1 次。每天觀察并用數(shù)碼相機(jī)拍攝每只小鼠表皮顏色變化； 記錄每組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入毛發(fā)生長(zhǎng)期的小鼠數(shù)目； 記錄干預(yù)14、21 d 各組小鼠新生毛發(fā)的長(zhǎng)度； 同時(shí)記錄干預(yù)21 d 各組小鼠新生毛發(fā)的質(zhì)量。

2.2 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫發(fā)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

2.2.1 雄激素性脫毛小鼠模型建立 將丙酸睪酮用橄欖油進(jìn)行稀釋，超聲混勻后配成5 mg/mL 的溶液，小鼠背部皮下注射（5 mg/kg），持續(xù)6 周，建立脫毛模型［9］。造模3周后，小鼠背部毛發(fā)開始失去光澤，隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠背部毛發(fā)出現(xiàn)不同程度的脫落（圖1）； 造模6 周后，小鼠背部毛發(fā)脫落加劇，部分融合成片，毛干從終毛的粗大深黑轉(zhuǎn)換為細(xì)小無色素的毳毛，終毛的數(shù)量減少，毳毛的數(shù)量增多，符合雄激素性脫發(fā)的病理改變，提示造模成功［10］。

圖1 經(jīng)皮注射丙酸睪酮后小鼠毛發(fā)的變化

2.2.2 分組及給藥 取造模成功的26 只小鼠，隨機(jī)分為模型組、養(yǎng)發(fā)精華液組，每組13 只，另取13 只未注射雄激素（丙酸睪酮） 的健康小鼠作為空白組。養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠在脫毛處涂抹養(yǎng)發(fā)精華液0.2 mL，每天1 次，連續(xù)28 d，模型組和空白組以0.2 mL 75%乙醇代替養(yǎng)發(fā)精華液進(jìn)行相同處理。給藥最后一天，用直尺隨機(jī)量取各組小鼠脫毛處新生毛發(fā)的長(zhǎng)度； 記錄脫毛處相同面積內(nèi)各組小鼠新生毛發(fā)的質(zhì)量。

2.2.3 小鼠血清及皮膚組織T、DHT、E2、HGF 水平檢測(cè) 給藥結(jié)束后，小鼠禁食過夜，眼球取血，血液靜置后3 500 r/min 離心15 min，收集上層血清； 去除小鼠背部毛后，取背部皮膚，稱重并加入10 倍量冷的生理鹽水，制備勻漿，離心后取上清。按相應(yīng)試劑盒說明書，采用ELISA法檢測(cè)血清中T、DHT、E2及皮膚組織勻漿中T、DHT、HGF 水平。

2.2.4 Western blot 法檢測(cè)小鼠皮膚組織β-catenin 和GSK-3β 蛋白表達(dá) 取背部實(shí)驗(yàn)區(qū)皮膚組織，剪碎后加入組織裂解液，勻漿，離心后提取蛋白。按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量。取40 μg 蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺（SDS-PAGE） 電泳，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以β-actin 為內(nèi)參，分別加入待檢測(cè)蛋白一抗4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，最后加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，毛發(fā)長(zhǎng)滿的程度采用Kaplan-Meier 生存曲線表示，兩兩比較采用Log-rank 檢驗(yàn)； 其他數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏脫毛小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

3.1.1 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏脫毛小鼠皮膚顏色的影響 由表1 可知，第5、7 天時(shí)，養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠皮膚顏色由粉變灰比率高于陽性對(duì)照米諾地爾組； 在第7 天時(shí)，高劑量組小鼠皮膚顏色全部轉(zhuǎn)灰，而空白組只有70%小鼠皮膚變?yōu)榛疑？瞻捉M小鼠皮膚在第10 天開始由灰變黑，直至第13 天所有小鼠皮膚均為黑色； 養(yǎng)發(fā)精華液中、高劑量組小鼠第9 天時(shí)有30%和40%的小鼠皮膚由灰變黑，高劑量組小鼠在第11 天皮膚全部變?yōu)楹谏?/p>

表1 養(yǎng)發(fā)精華液處理不同時(shí)間對(duì)脫毛膏脫毛小鼠皮膚顏色變化的影響（n＝13）

3.1.2 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏脫毛小鼠新生毛發(fā)的影響 由表2 可知，空白組小鼠第5 天開始出現(xiàn)新生毛發(fā)，至第7天有45%小鼠長(zhǎng)出新生毛發(fā)； 養(yǎng)發(fā)精華液高劑量組和米諾地爾組小鼠均在第3 天出現(xiàn)新生毛發(fā)； 但養(yǎng)發(fā)精華液各劑量組小鼠第7 天新生毛發(fā)的比例分別為61%、69%和69%，高于陽性對(duì)照米諾地爾組。空白組在第12 天出現(xiàn)長(zhǎng)滿毛的小鼠，第14 天有40%小鼠長(zhǎng)滿毛； 養(yǎng)發(fā)精華液各劑量組在第10 天均出現(xiàn)長(zhǎng)滿毛的小鼠，第14 天新生毛發(fā)小鼠數(shù)量呈劑量依賴性地增加，其比例分別為60%、80% 和90%，且中、高劑量組長(zhǎng)滿毛的小鼠比率高于空白組（P＜0.05）。

表2 養(yǎng)發(fā)精華液處理不同時(shí)間對(duì)脫毛膏脫毛小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響（n＝13）

3.1.3 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏脫毛小鼠新生毛發(fā)質(zhì)量和長(zhǎng)度的影響 由表3 可知，與空白組比較，養(yǎng)發(fā)精華液低、中劑量組和米諾地爾組毛發(fā)質(zhì)量均增加（P＜0.05），但養(yǎng)發(fā)精華液高劑量組小鼠毛發(fā)質(zhì)量卻未見明顯變化（P＞0.05）。第14 天，與空白組比較，養(yǎng)發(fā)精華液低、中劑量組及米諾地爾組小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度無明顯變化（P＞0.05），而養(yǎng)發(fā)精華液高劑量組小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度變長(zhǎng)（P＜0.05）； 第21 天，各組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)均進(jìn)入休止期，各組之間的毛發(fā)長(zhǎng)度均無明顯差異（P＞0.05）。

表3 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏脫毛小鼠毛發(fā)質(zhì)量和長(zhǎng)度的影響（±s，n＝13）

表3 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)脫毛膏脫毛小鼠毛發(fā)質(zhì)量和長(zhǎng)度的影響（±s，n＝13）

注： 與空白組比較，?P＜0.05。

組別毛發(fā)質(zhì)量/（μg·cm－2）毛發(fā)長(zhǎng)度/cm第14 天第21 天空白組26.52±4.020.41±0.060.77±0.12精華液低劑量組31.02±2.50?0.37±0.100.73±0.10精華液中劑量組30.98±2.04?0.38±0.080.74±0.07精華液高劑量組27.52±1.860.50±0.08?0.75±0.10米諾地爾組32.96±5.01?0.47±0.080.78±0.09

3.2 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響

3.2.1 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)狀態(tài)的影響 如圖2 所示，空白組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)背部毛發(fā)均覆蓋完整，毛色有光澤； 模型組小鼠在整個(gè)干預(yù)周期內(nèi)背部毛發(fā)脫落，部分脫毛區(qū)融合成片，毛發(fā)無光澤； 給藥2周后（第9 周） 養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠背部毛發(fā)略薄，可見少許毛發(fā)散在脫落的點(diǎn)狀區(qū)域； 給藥4 周后（第11 周） 養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠背部毛發(fā)比模型組增多，毛色更有光澤。

圖2 養(yǎng)發(fā)精華液處理后雄激素性脫毛小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)情況

3.2.2 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度的影響 在干預(yù)28 d 后，養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度較空白組無明顯變化，較模型組增長(zhǎng)（P＜0.05），見表4。

表4 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度的影響（±s，n＝13）

表4 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度的影響（±s，n＝13）

注： 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別毛發(fā)長(zhǎng)度/cm空白組0.71±0.09模型組0.60±0.08養(yǎng)發(fā)精華組0.77±0.07＃

3.2.3 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠血清和皮膚組織激素、HGF 水平的影響 如表5 所示，與空白組比較，模型組血清T、DHT 和皮膚組織HGF 水平升高（P＜0.05），說明性激素平衡狀態(tài)改變，模型建立成功； 與模型組比較，養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠皮膚組織T 及血清、皮膚組織DHT 水平降低（P＜0.05），血清E2和T 水平雖無明顯變化（P＞0.05），但血清E2水平增加了34.15%，血清T 水平降低了6.20%。與空白組比較，模型組HGF 代償性高表達(dá)（P＜0.05）； 與模型組比較，養(yǎng)發(fā)精華液組皮膚組織HGF 水平降低（P＜0.05），接近空白組。

表5 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠血清和皮膚組織DHT、E2、T 和HGF 水平的影響（±s，n＝13）

表5 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠血清和皮膚組織DHT、E2、T 和HGF 水平的影響（±s，n＝13）

注： 與空白組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05。

組別血清皮膚DHT/（nmol·L－1）T/（μg·L－1）E2/（ng·L－1）DHT/（nmol·mg prot－1） T/（μg·mg prot－1） HGF/（ng·mg prot－1）空白組1.40±0.390.33±0.1953.87±19.0112.55±0.410.86±0.1424.11±18.82模型組20.15±0.89?20.49±1.30?63.31±18.8114.54±2.340.93±0.1791.40±30.92?養(yǎng)發(fā)精華組18.32±0.55＃19.22±2.10?84.93±33.458.66±2.37＃0.62±0.12＃30.11±13.26＃

3.2.4 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠皮膚組織β-catenin和GSK-3β 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織GSK-3β 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），βcatenin 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠皮膚組織GSK-3β 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），βcatenin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖3 養(yǎng)發(fā)精華液對(duì)雄激素性脫毛小鼠皮膚組織GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝13）

4 討論

C57BL/6 小鼠是篩選毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)劑的常用動(dòng)物［11］，本研究建立脫毛膏法和丙酸睪酮法2 種脫毛模型，用植物源養(yǎng)發(fā)精華液進(jìn)行處理，通過對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)周期的觀察以及雄激素水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)發(fā)精華液組小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度和質(zhì)量增加，血清和皮膚組織中T 和DHT 的水平下降，證明養(yǎng)發(fā)精華液在促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)及向終毛轉(zhuǎn)化的良好效果，對(duì)化學(xué)性試劑和雄激素性脫毛模型小鼠都有明顯的促毛發(fā)生長(zhǎng)作用。

T 是男性的主要雄激素，T 及其代謝產(chǎn)物DHT 和E2水平與雄激素脫發(fā)直接相關(guān)，T 在毛囊中5α-還原酶的作用下，生成活性更高的DHT，進(jìn)而影響了真皮乳頭與毛囊細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制［12］。DHT 是雄激素脫發(fā)的主要原因［13］，治療雄激素性脫發(fā)藥物非那雄胺是一種特殊的5α 受體阻滯劑，通過抑制DHT 的生成降低循環(huán)中濃度從而促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)； Murata 等［14］研究揭示，紅參提取物人參皂甙Ro 可通過抑制5α-還原酶的活性來增強(qiáng)雄激素性脫發(fā)小鼠毛發(fā)的再生長(zhǎng)。由性腺分泌的E2可以起到一定促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的作用，在正常情況下，T 與E2的水平固定且處于相對(duì)平衡狀態(tài)。DHT 水平升高致使二者的平衡比例被打破，引發(fā)毛發(fā)脫落［9］。

毛囊干細(xì)胞（HFSCs） 是位于毛囊隆突部的一種成體干細(xì)胞，具有分化成毛囊、表皮、皮脂腺等多向潛能，HFSCs 的循環(huán)激活和抑制主導(dǎo)頭發(fā)周期性變化［15-16］，在已知的調(diào)節(jié)HFSCs 分化的信號(hào)通路中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是調(diào)控毛囊的形態(tài)發(fā)生和毛發(fā)周期的關(guān)鍵信號(hào)通路，在毛發(fā)形成和循環(huán)中起至關(guān)重要誘導(dǎo)作用［17-18］。研究顯示，β-catenin 表達(dá)增高是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活的標(biāo)志，高水平的Wnt/β-catenin 能促毛囊干細(xì)胞（HFSCs） 向毛囊分化，低水平的β-catenin 可導(dǎo)致HFSCs 向表皮細(xì)胞或皮脂腺方向分化，DHT 可激活Wnt 負(fù)調(diào)節(jié)因子GSK-3β 并抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)［12］。何首烏是用于治療禿發(fā)和脫發(fā)的傳統(tǒng)中藥材，有研究證實(shí)何首烏提取物促C57BL/6 小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的分子機(jī)制與其誘導(dǎo)的β-catenin 蛋白表達(dá)有關(guān)［19］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠皮膚組織GSK-3β 蛋白表達(dá)升高，β-catenin 蛋白表達(dá)降低，說明雄激素性脫毛小鼠皮膚組織Wnt/β-catenin 信號(hào)通路受到抑制，進(jìn)而抑制了毛囊周期性的再生，抑制了毛發(fā)的生長(zhǎng)； 而涂抹養(yǎng)發(fā)精華液后小鼠皮膚組織GSK-3β 蛋白表達(dá)降低，β-catenin 蛋白表達(dá)升高，說明Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被激活，激活了干細(xì)胞的增殖和毛囊的再生，啟動(dòng)毛發(fā)周期，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)［20］。本研究首次發(fā)現(xiàn)植物源詩碧曼養(yǎng)發(fā)精華液可以激活小鼠皮膚毛囊、促進(jìn)血液循環(huán)、加快黑色素生成，為我國(guó)中草藥養(yǎng)發(fā)的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供了方向，但其臨床療效尚需進(jìn)一步研究。