補陽還五湯通過Cav-1 抑制鐵死亡對腦缺血小鼠的神經(jīng)保護作用

劉英飛，陳博威，田豐銘，歐陽銀，易 健，劉柏炎，4?

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208； 2.益陽醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院，湖南 益陽 413046；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410021； 4.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013）

腦缺血為一種常見的腦血管疾病，是全球致死和成人致殘的主要原因，嚴重威脅人類的健康，給患者及其家庭、社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔［1］，但目前仍缺乏有效的治療手段，因此進一步闡明腦缺血后病理機制以及開發(fā)有效的神經(jīng)保護制劑成為目前亟需解決的問題。研究表明鐵死亡參與腦缺血病理過程并加重腦組織損傷，而使用鐵死亡抑制劑可改善腦缺血預后［2］。Cav-1 為位于細胞膜表面質(zhì)膜凹陷，是胞膜窖（caveolae） 的標志性蛋白和功能蛋白，為體內(nèi)外細胞信號轉導樞紐。既往研究發(fā)現(xiàn)Cav-1 可調(diào)控鐵死亡而發(fā)揮作用； Cav-1 抑制鐵死亡減輕急性肝炎小鼠肝細胞損傷［3］； Tang 等［4］發(fā)現(xiàn)Cav-1 可抑制神經(jīng)元鐵死亡，從而改善認知功能。

補陽還五湯作為治療腦缺血的經(jīng)典名方，其療效性和安全性已得到充分證明［5-7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯可通過Cav-1 發(fā)揮抗腦缺血損傷作用［8-9］，但是補陽還五湯是否通過Cav-1 調(diào)控鐵死亡而發(fā)揮抗缺血作用，目前仍不清楚。因此，本研究擬以Cav-1 KO 和同源WT 小鼠作為研究對象，采用MCAO 法復制腦缺血模型，觀察補陽還五湯對腦缺血小鼠病理形態(tài)以及鐵死亡相關分子的影響，研究其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性KO （Cav-1－/－） 與同源WT （Cav-1＋/＋） C57BL/6J 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量25 ～30 g。Cav-1雜合子（Cav-1＋/－） 小鼠引種自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘） 2018-0008］，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF 級動物房［實驗動物使用許可證號SYXK （湘） 2020-0010） ］，小鼠子代經(jīng)PCR 鑒定為KO 與同源WT 小鼠后納入實驗［10］。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（倫理號ZYFY20221111-04）。

1.2 藥物 黃芪飲片（批號CK21110807）、赤芍飲片（批號CK21111703）、川芎飲片（批號2108221）、桃仁飲片（批號2020050402）、當歸飲片（批號TH21111711）、地龍飲片（批號2109142） 及紅花飲片（批號2109223） 均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，并經(jīng)本院中心實驗室中藥藥效物質(zhì)基礎平臺龍紅萍副研究員鑒定為正品。

1.3 試劑 組織鐵測定試劑盒（貨號A039-2-1）、還原型谷胱甘肽測定試劑盒（貨號A006-1-1）、丙二醛測定試劑盒（貨號A003-1-2） 及超氧化物歧化酶測定試劑盒（貨號A001-3） 均購自南京建成生物工程研究所； 動物RNA 抽提取試劑盒 （貨號 R002）、cDNA 合成試劑盒 （貨號R7170M） 及SYBR Green qPCR Mix （貨號D7260） 均購自上海碧云天生物技術有限公司； GPX4 多克隆抗體（貨號14432-1AP） 購自武漢三鷹生物技術有限公司； HRP-山羊抗兔IgG （貨號BA1054） 購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器 智能組織切片成像系統(tǒng)（美國Akoya Bioscienc公司，型號Vectra3）； 熒光定量PCR 儀（德國Eppendorf公司，型號Realplex2）； 梯度PCR 擴增儀（美國Bio-Rad公司，型號T100）； 電鏡（日本日立公司，型號HT7700）；多功能酶標儀（美國賽默飛公司，型號Enspire）； 高速冷凍離心機（德國Hermle 公司，型號Z32HK）。

2 方法

2.1 補陽還五湯制備 將黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花按120 ∶6 ∶4.5 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 比例混合，加入5 倍體積量蒸餾水浸泡1 h，先武火煎0.5 h，然后文火煎1.5 h，用三層紗布過濾藥液； 再次加入3 倍體積量蒸餾水，用上述方法煎煮及過濾，最后將2 次濾液混勻，使用旋轉蒸發(fā)儀將藥液濃縮至生藥量2 g/mL。濃縮液經(jīng)課題組前期UPLC-Q-TOFMS 檢測出21 種成分，其中黃芪甲苷Ⅳ、芒柄花素、阿魏酸、芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)量濃度分別為78.1、46.7、45.6、468.4 μg/mL［11］。

2.2 MCAO 模型建立 采用改良的大腦中動脈栓塞法制備腦缺血模型［12］，小鼠術前禁食12 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后固定小鼠，切開皮膚，鈍性分離左側頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，結扎頸總動脈及頸外動脈，于頸總動脈近心端剪一小切口，將線栓經(jīng)切口處送入頸內(nèi)動脈，當線栓上黑色標記點恰好位于頸總動脈分叉口時固定線栓，消毒并縫合皮膚。假手術組小鼠僅切開皮膚并分離血管，隨后縫合皮膚。小鼠麻醉清醒后2 h，參照Longa 法［13］對小鼠進行神經(jīng)行為學評分，評分為1～3 分者納入研究對象。

2.3 分組和給藥 將KO 和同源WT 小鼠分別隨機分為假手術組、模型組和補陽還五湯組，每組18 只。補陽還五湯組于造模后1 d 灌胃給予補陽還五湯，根據(jù)課題組前期研究基礎［8，14］，確定其給藥質(zhì)量濃度為18.5 g/kg，其余各組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)灌胃7 d。

2.4 取材 末次灌胃給藥1 h 后，每組隨機選取6 只小鼠進行神經(jīng)功能評分。然后麻醉處死全部小鼠留取腦組織，隨機選取6 只用于病理形態(tài)學及免疫組化等指標檢測； 6只用于RT-qPCR 檢測； 其余6 只用于相關試劑盒相關指標的檢測。

2.5 神經(jīng)行為學評分 采用改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological deficit score，mNSS） 對小鼠神經(jīng)功能缺損進行評估［15］，該評分內(nèi)容涉及感覺、運動及反射等方面，總分為18 分，0 分代表無神經(jīng)功能缺損，評分越高，說明神經(jīng)損傷越嚴重。

2.6 HE 染色觀察腦組織病理變化 取全腦于4% 多聚甲醛中浸泡、固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、烤片，然后脫蠟至水，以蘇木精-伊紅（HE） 染色后自來水沖水，脫水透明后封片，使用智能組織切片成像系統(tǒng)進行全片掃描，隨機選取皮質(zhì)缺血區(qū)域內(nèi)3 個不同區(qū)域拍照并保存圖片。

2.7 尼氏染色觀察神經(jīng)元結構 將腦組織石蠟切片脫蠟至水，然后使用尼氏染液進行染色，脫水透明后封片，使用智能組織切片成像系統(tǒng)進行全片掃描，隨機選取皮質(zhì)缺血區(qū)域內(nèi)3 個不同區(qū)域拍照并保存圖片。

2.8 透射電鏡觀察腦組織線粒體結構 冰上取缺血側皮層腦組織塊約1 mm3，然后立即置于電鏡固定液中避光固定，4 ℃過夜，經(jīng)室溫脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體形態(tài)，并采集圖像。

2.9 腦組織鐵、GSH、MDA 水平及SOD 活性檢測 準確稱取25 mg 缺血側皮層腦組織，加入9 倍量生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液待測。根據(jù)BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度，按照組織鐵、GSH、MDA 以及SOD 試劑盒說明書進行檢測，并根據(jù)試劑盒提供的公式計算腦組織鐵、GSH、MDA 水平及SOD活性。

2.10 免疫組化法檢測腦組織GPX4 蛋白表達 取全腦組織石蠟切片，依次脫蠟至水、熱抗原修復及封閉，分別加入GPX4 一抗（1 ∶100） 4 ℃孵育過夜，滴加含HRP 的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 沖洗后封片。使用智能組織切片成像系統(tǒng)進行全片掃描，隨機選取缺血區(qū)域3 個不同視野拍照并保存照片，運用Image J 圖像分析軟件計算其蛋白表達量。

2.11 RT-qPCR 法檢測腦組織GPX4 mRNA 表達 稱取20 mg 缺血側腦組織置于1.5 mL 離心管中，迅速加入預冷裂解液300 μL，勻漿，通過離心柱法抽提RNA，然后將RNA逆轉錄為cDNA，在熒光定量系統(tǒng)中采用兩步法進行PCR擴增，PCR 擴增程序為95 ℃預變性2 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個循環(huán)。熔解曲線反應條件為95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司設計并合成，序列見表1。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCT法計算GPX4 mRNA 相對表達。

表1 引物序列

2.12 統(tǒng)計學分析 通過GraphPad Prism 9 軟件進行處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用方差分析，隨后采用Turkey 進行事后檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)行為學評分的影響 與同基因型假手術組比較，WT 和KO 模型組小鼠神經(jīng)行為學評分升高 （P＜0.01）； 與同基因型模型組比較，WT 和KO 補陽還五湯組小鼠神經(jīng)行為學評分降低（P＜0.01）； KO 模型組神經(jīng)行為學評分高于WT 模型組（P＜0.05），KO 補陽還五湯組神經(jīng)行為學評分高于WT 補陽還五湯組（P＜0.01），見表2。

表2 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)行為學評分的影響（±s，n＝6）

表2 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)行為學評分的影響（±s，n＝6）

注： 與同基因型假手術組比較，??P＜0.01； 與同基因型模型組比較，△△P＜0.01； 與WT 模型組比較，◇P＜0.05； 與WT 補陽還五湯組比較，＃＃P＜0.01。

組別神經(jīng)行為學評分/分WTKO假手術組00模型組6.17±0.69??7.5±0.55??◇補陽還五湯組0.67±0.52△△3.83±1.17△△＃＃

3.2 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織病理形態(tài)的影響 HE 染色結果顯示，與同基因型假手術組比較，WT、KO 模型組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元排列不規(guī)整，細胞間隙增寬、水腫，存在空泡，細胞核出現(xiàn)固縮，甚至核碎裂； 與同基因型模型組比較，WT、KO 補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對規(guī)整，細胞間隙減小，核仁較清晰；與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)大量核固縮及空泡； 與WT 補陽還五湯組比較，KO 補陽還五湯組小鼠缺血側皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對欠規(guī)整，存在更多空泡，見圖1。尼氏染色結果顯示，假手術組小鼠皮層神經(jīng)元結構完整，邊界清晰，可見大量呈深藍色顆粒或斑塊狀尼氏體，核呈藍色； WT、KO 模型組小鼠神經(jīng)元結構紊亂，可見細胞腫脹，甚至呈空泡樣改變，細胞核固縮，甚至核碎裂等，尼氏體數(shù)量減少（P＜0.01）； 與WT 模型組比較，KO 模型組表現(xiàn)出更嚴重的神經(jīng)元損傷，尼氏體數(shù)量更少（P＜0.05）； 與WT 補陽還五湯組比較，KO 補陽還五湯組尼神經(jīng)元損傷嚴重，尼氏體數(shù)量減少（P＜0.01），見圖2。

圖1 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織病理形態(tài)的影響（HE，×400）

圖2 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠神經(jīng)元細胞形態(tài)的影響（尼氏染色，×400，±s，n＝6）

3.3 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織線粒體形態(tài)的影響 與假手術組比較較，模型組腦缺血區(qū)域線粒體變小、水腫嚴重，線粒體膜密度增加，嵴減少甚至消失，線粒體外膜破裂等，其中KO 模型組線粒體損傷更嚴重； 給予補陽還五湯干預后，線粒體形態(tài)改善，但KO 補陽還五湯組線粒體形態(tài)改善不如WT 補陽還五湯組，仍可見部分線粒體水腫、線粒體嵴減少、線粒體膜密度增加等，見圖3。

圖3 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織線粒體形態(tài)學的影響（n＝3）

3.4 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織鐵水平及脂質(zhì)過氧化的影響 與同基因型假手術組比較，WT、KO 模型組小鼠腦組織GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.01），MDA 和鐵水平升高（P＜0.01）； 與同基因模型組比較，WT、KO 補陽還五湯組小鼠腦內(nèi)腦組織GSH 水平和SOD 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 和鐵水平降低 （P＜0.05，P＜0.01）； 與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠腦組織GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 和鐵水平升高（P＜0.05）； 與WT 補陽還五湯組比較，KO 補陽還五湯組小鼠腦組織GSH 水平和SOD 活性降低（P＜0.01），MDA和鐵水平升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織鐵、GSH、MDA 水平及SOD 活性的影響（±s，n＝6）

3.5 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織GPX4 蛋白和mRNA 表達的影響 與同基因型假手術組比較，WT、KO 模型組小鼠腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達降低（P＜0.01）； 與同基因型模型組比較，WT、KO 補陽還五湯組小鼠腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 與WT 模型組比較，KO 模型組小鼠腦組織GPX4蛋白及mRNA 表達降低（P＜0.05）； 與WT 補陽還五湯組比較，KO 補陽還五湯組腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 補陽還五湯對Cav-1－/－腦缺血小鼠腦組織GPX4 蛋白及mRNA 表達的影響（±s，n＝6）

4 討論

腦缺血屬于中醫(yī)“缺血性中風” 范疇，病因病機多為風、火、痰、瘀等留滯經(jīng)絡，氣血運動不暢，其中氣虛血瘀為其重要的病理因素［16］。補陽還五湯出自《醫(yī)林改錯》，為治療缺血性中風氣虛血瘀證的經(jīng)典方劑。該方由黃芪、當歸尾、地龍、川芎、赤芍、桃仁和紅花等組成，方中重用黃芪為君藥，大補元氣，使氣旺血行； 臣以當歸尾活血化瘀而不傷血，佐以川芎、赤芍、桃仁、紅花等藥物行氣活血，地龍通絡，全方共湊益氣活血通絡之功效，具有氣旺血行、活血而不傷正等特點。本研究表明，補陽還五湯能降低神經(jīng)功能缺損評分，改善缺血區(qū)域病理形態(tài)而發(fā)揮抗腦缺血損傷作用，說明補陽還五湯具有抗腦缺血損傷作用。

腦缺血后病理機制復雜，如氧化應激、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、炎癥等，伴隨凋亡、自噬、焦亡等多種細胞死亡形式［17-18］。鐵死亡是一種非經(jīng)典細胞死亡方式，以鐵依賴的脂質(zhì)過氧化為特征，在腦缺血病理過程中發(fā)揮重要作用。GPX4 為鐵死亡的標志性蛋白，它以GSH 為底物，將有毒的脂質(zhì)過氧化物轉化為無毒的脂質(zhì)醇，從而維持體內(nèi)氧化還原體系平衡［19］。既往研究表明，腦缺血后鐵水平增加，GSH 及GPX4 水平降低，增加腦內(nèi)GPX4 表達量能改善腦缺血預后［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠缺血側腦組織內(nèi)線粒體變小，水腫嚴重，嵴減弱甚至消失，呈典型的鐵死亡線粒體形態(tài)學變化。腦組織鐵、MDA 水平增加，而GSH、SOD 和GPX4 水平減少，以上結果表明鐵死亡參與腦缺血病理過程。補陽還五湯干預后能改善線粒體形態(tài)，降低腦組織鐵和MDA 水平，增加GSH、SOD 和GPX4 水平，提示補陽還五湯可能通過抑制神經(jīng)元鐵死亡而發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。

Cav-1 為caveolae 的重要結構蛋白和功能蛋白，通過其腳手架結構域激活下游信號分子，廣泛參與細胞增殖、遷移以及胞吞、脂質(zhì)代謝、細胞信號轉導等生理過程［21］。Cav-1 在腦內(nèi)神經(jīng)元中表達豐富，不僅參與大腦發(fā)育，而且在腦缺血病理過程中發(fā)揮重要作用［22］。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達Cav-1 可減輕缺氧條件下海馬神經(jīng)元凋亡［23］，而敲除Cav-1 會增加腦缺血小鼠的梗死面積及血腦屏障的通透性，從而加重腦缺血［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，與WT 模型組小鼠比較，Cav-1 KO 模型小鼠表現(xiàn)出更嚴重的神經(jīng)功能缺損癥狀及缺血區(qū)域神經(jīng)元損傷，這與既往研究一致。同時，敲除Cav-1可在一定程度上削弱補陽還五湯的抗腦缺血損傷作用，說明補陽還五湯可能通過Cav-1 發(fā)揮抗腦缺血損傷作用。在本研究中，與WT 模型組小鼠比較，Cav-1 KO 小鼠腦缺血后表現(xiàn)出更嚴重的線粒體損傷，腦內(nèi)鐵和MDA 水平增加，而GSH、SOD 及GPX4 水平減少，并且Cav-1 KO 能在一定程度上逆轉補陽還五湯抑制鐵死亡的效果。以上結果表明，Cav-1 缺失能促進腦內(nèi)鐵死亡，補陽還五湯可能通過Cav-1抑制鐵死亡而發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cav-1 敲除進一步加重腦缺血后鐵死亡，而補陽還五湯可能通過Cav-1 抑制鐵死亡而發(fā)揮保護腦缺血的作用，但補陽還五湯通過Cav-1 調(diào)控鐵死亡的下游靶點不明確，這將是課題組下一步研究的重點。