日常飲食中添加攝食甜菜堿對APP/PS1 轉基因小鼠的影響

張麗陽，孫 軍，陳 笛，張在行

（南陽市中心醫院神經內科，河南 南陽 473000）

甜菜堿是一種吡啶衍生物類含氮色素，廣泛存在于多種石竹目科植物的花和果實中，目前已實現人工化學合成［1］。甜菜堿主要被用為食品添加劑、清潔類護膚品、藥品和保健品［2］。人體內甜菜堿的主要來源為膽堿前體代謝和飲食［3］。在哺乳動物中，甜菜堿可作為甲基供體將同型半胱氨酸（Hcy） 轉化為蛋氨酸［4］。Hcy 是一種神經毒性氨基酸，是多種神經退行性疾病的獨立危險因素。已有研究表明，血清中高濃度Hcy 可加速β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積并增加阿爾茨海默病（AD） 的發病率［5］。此前已有研究顯示，甜菜堿可減輕Hcy 引起的大鼠AD 樣病理改變和記憶功能障礙［6］。在3×Tg AD 模型小鼠中，同樣發現持續攝入甜菜堿可改善認知功能障礙［7］。最近也有一項研究表明，攝食甜菜堿可改善AD 患者的認知功能障礙［8］。而攝食甜菜堿在AD 的海馬神經發生和突觸功能中的作用并不清楚，因此，本研究利用APP/PS1 （APPswe和PSEN1dE9） 雙轉基因AD 模型小鼠研究甜菜堿對記憶障礙、AD 病理癥狀、海馬神經元再生和突觸可塑性的影響。

1 材料

1.1 動物 30 只6 月齡SPF 級雄性APP/PS1 雙轉基因小鼠、15 只6 月齡SPF 級雄性野生型C57BL/6J 小鼠購自蘇州賽業模式生物研究中心有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （蘇） 2020-0006。飼養于南陽理工學院SPF 級動物飼養平臺，實驗動物使用許可證號SYXK （豫） 2020-0013，12 h/12 h 光暗循環，溫度（24±1）℃，相對濕度（55±5）%，小鼠自由進食飲水，適應性飼養1 周。本研究獲得南陽市中心醫院倫理委員會審批（倫理號20200434）。

1.2 試劑 甜菜堿（純度＞98%，貨號B802317）、曲拉通（Triton） X-100 （貨號 T6328）、RIPA 裂解液 （貨號R874809）、4%多聚甲醛固定液（貨號P885233） 購自上海麥克林生化科技有限公司； OCT 冷凍切片包埋劑（貨號4583） 購自上海索寶生物科技有限公司； EdU 試劑（貨號E6032）、WonderOrangeTM蛋白定量試劑盒（貨號W6006）、超敏化學發光檢測試劑盒（貨號S6009）、YF ? 488 羊抗小鼠IgG （H＋L） （貨號Y6104）、YF ?647 羊抗小鼠或兔IgG （H＋L） （貨號Y6108、Y6109）、抗熒光淬滅固化劑（貨號A4083） 購自蘇州宇恒生物科技有限公司； AAV-GFP（貨號V1-001） 購自廣州派洛摩爾生物技術有限公司； Aβ抗體（貨號sc-28365）、雙皮質素（DCX） 抗體（貨號sc-271390）、巢蛋白（Nestin） 抗體（貨號sc-23927） 購自美國Santa Cruz 公司； 神經元核抗原（NeuN） 抗體（貨號BS6808）、蛋白突觸后致密蛋白-95 （PSD-95） 抗體（貨號BS2978）、突觸小泡蛋白（SYN） 抗體（貨號BS1345）、神經元結構相關蛋白微管相關蛋白（MAP-2） 抗體（貨號MB0078） 購自南京巴傲得生物科技有限公司； 兔源β-actin抗體（貨號WL01372）、HRP 標記山羊抗兔IgG （H ＋L）（貨號WLA023） 購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 儀器 YH-WM-M/R 型Morris 水迷宮儀（武漢一鴻科技有限公司）； EthoVision XT 型小動物運動軌跡跟蹤監測系統（荷蘭Noldus Information Technology 公司）； VT1200S型全自動振動切片機（德國Leica 公司）； Axio Scope A1 型熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）； PT-3502G 型多功能酶標儀（北京普天新橋技術有限公司）； Tanon V8 型Western blot 轉印系統、Tanon 1600 型全自動凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）； SZ810 型體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）； Axon 膜片鉗系統（美國Molecular Devices 公司）。

2 方法

2.1 分組與干預 30 只APP/PS1 小鼠隨機分為正常飲食組和甜菜堿補充飲食組，每組15 只，其中正常飲食組APP/PS1 小鼠給予正常飲食（標準動物顆粒飼料），甜菜堿補充飲食組APP/PS1 小鼠給予甜菜堿補充飲食（標準動物顆粒飼料中添加5 g/kg 甜菜堿）。同時納入15 只野生型C57BL/6J 小鼠給予正常飲食，作為空白對照組。上述3 組小鼠均經上述方案飼養3 個月。

2.2 Morris 水迷宮實驗 泳池隨機分為4 個象限，水溫25 ℃，站臺隨機置于一個象限中，并低于水面1 cm。實驗開始前2 d，每天訓練小鼠在隨機不同的象限入水至爬上站臺，以適應實驗環境； 隨后5 d，將小鼠放置在站臺以外的一個象限入水，用小動物運動軌跡跟蹤監測系統記錄小鼠找到站臺所用時間（逃避潛伏期） 和計算平均游泳速度。第6 天，將站臺下沉至泳池底部，從站臺以外的一個象限的同一個入水點入水，小動物運動軌跡跟蹤監測系統記錄小鼠穿過原站臺位置的次數和尋找原站臺位置的時間。

2.3 腦立體定位注射AAV-GFP 并于熒光顯微鏡下觀察棘突形態 每組選取5 只小鼠，麻醉后，置于小鼠腦立體定位注射儀上，并將100 nL AAV-GFP 注入小鼠CA1 區。4 d后，深度麻醉小鼠，斷頸后快速取出完整腦組織，用體式顯微鏡在冰上快速分離出海馬，4%多聚甲醛固定過夜，第2 天在4 ℃下分別用20%、30% 蔗糖依次脫水過夜，OCT包埋，并用全自動振動切片機連續切成6 μm 厚切片，在熒光顯微鏡下觀察CA1 區GFP 標記神經元的棘突，通過Image J 軟件測量棘突的密度。

2.4 免疫熒光法檢測Aβ、DCX、Nestin 陽性表達 選取5只小鼠，麻醉后按“2.3” 項下方法分離出海馬和皮質，并制作6 μm 厚冰凍腦片。分別將海馬或皮質切片室溫風干，PBS 浸泡10 min，風干，用0.3% Trition X-100 處理3 min，PBS 沖洗2 次，10%山羊血清在37 ℃下封閉1 h。分別加入Aβ （1 ∶1 000）、DCX （1 ∶1 000）、Nestin （1 ∶500） 一抗室溫孵育1 h 后4 ℃過夜，第2 天洗滌后，加入YF?488 羊抗小鼠IgG （H＋L）、YF ? 647 羊抗小鼠IgG（H＋L） 熒光二抗（1 ∶500），室溫孵育1 h，PBS 洗滌后，DAPI 染色5 min，抗熒光淬滅固化劑封片，熒光顯微鏡下隨機選取3 個視野，通過Image J 軟件分析陽性信號。

2.5 電生理記錄長時程增強（LTP） 效應 取400 μm 厚的海馬區腦組織切片，用人工腦脊液灌流，并在顯微鏡下將刺激電極置于CA3 區錐體層Schaffer 側枝，記錄電極置于CA1 區放射層。用單個電脈沖（100 Hz） 刺激1 s，共3次，每次間隔5 min，觀察興奮性突觸后電位（fEPSP），待fEPSP 穩定后，取50%最大fEPSP 的刺激作為高頻條件刺激20 min，誘導出LTP。用Clampex 9.0 采集數據，數據以fEPSP 的斜率表示，并對數據進行分析。

2.6 NeuN 和EdU 雙標熒光染色法檢測NeuN 陽性表達 取5 只小鼠給予腹腔注射50 mg/kg EdU，繼續飼養4 d。按“2.3” 項下方法制作海馬切片并進行NeuN （1 ∶1 000） 免疫熒光染色。切片分別加入YF ? 647 羊抗兔IgG （H＋L）熒光二抗（1 ∶500） 和YF ? 488 標記的EdU 檢測工作液并室溫孵育1 h，PBS 洗滌后，抗熒光淬滅固化劑封片，熒光顯微鏡下隨機選取3 個視野，通過Image J 軟件分析陽性信號。

2.7 Western blot 法檢測海馬組織PSD-95、SYN、MAP-2蛋白表達 用RIPA 裂解液裂解海馬組織，取蛋白并定量。取等量蛋白電泳、轉膜。封閉膜上非特異性抗原后加入PSD-95 （1 ∶ 1 000）、SYN （1 ∶ 1 500）、MAP-2 （1 ∶3 000）、β-actin （1 ∶6 000） 一抗37 ℃下孵育1.5 h，洗膜后，室溫加入HRP 標記山羊抗兔IgG （H＋L） 二抗37 ℃下孵育45 min，洗膜后，通過Tanon 1600 型全自動凝膠成像系統用超敏化學發光檢測試劑盒成像，以β-actin 為內參，用自帶軟件分析目的蛋白相對表達。

2.8 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用事后多重分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 甜菜堿對APP/PS1 小鼠記憶行為的影響 與空白對照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠逃避潛伏期延長（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補充飲食組APP/PS1小鼠避潛伏期縮短（P＜0.01），平均游泳速率無明顯變化（P＞0.05）。站臺移除后，與空白對照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠探索隱藏站臺時間縮短（P＜0.01），穿越站臺次數減少（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補充飲食組APP/PS1 小鼠探索隱藏站臺時間延長（P＜0.01），穿越站臺次數增加（P＜0.01），見圖1。

圖1 甜菜堿對APP/PS1 小鼠記憶行為的影響（±s，n＝15）

3.2 甜菜堿對APP/PS1 小鼠海馬和皮質中Aβ 斑塊沉積的影響 與空白對照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠海馬和皮質中Aβ 斑塊沉積均增多（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補充飲食組APP/PS1 小鼠海馬和皮質中Aβ斑塊沉積均減少（P＜0.01），見圖2。

圖2 甜菜堿對APP/PS1 小鼠海馬和皮質中Aβ 斑塊沉積的影響（免疫熒光，×200，±s，n＝5）

3.3 甜菜堿對APP/PS1 小鼠海馬神經再生的影響 與空白對照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠海馬齒狀回（DG）、海馬齒狀回顆粒下區（SGZ） 中Nestin 陽性細胞數、DCX 陽性細胞數以及海馬中EdU 陽性神經元的數量降低 （P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補充飲食組APP/PS1小鼠DG 和SGZ 中Nestin 陽性細胞數、DCX 陽性細胞數以及海馬中EdU 陽性神經元的數量增加（P＜0.01），見圖3。

圖3 甜菜堿對APP/PS1 小鼠海馬神經再生的影響（±s，n＝5）

3.4 甜菜堿對APP/PS1 小鼠海馬神經元突觸可塑性的影響 與空白對照組比較，正常飲食組APP/PS1 小鼠海馬CA1 區神經元的棘突密度降低（P＜0.01），突觸后誘發fEPSP 幅值減小，斜率降低 （P＜0.01），海馬PSD-95、SYN、MAP-2 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與正常飲食組比較，甜菜堿補充飲食組APP/PS1 小鼠海馬CA1 區神經元的棘突密度升高（P＜0.01），突觸后誘發fEPSP 幅值增大，斜率增高（P＜0.01），海馬PSD-95、SYN、MAP-2 蛋白表達升高（P＜0.01），見圖4。

圖4 甜菜堿對APP/PS1 小鼠海馬神經元突觸可塑性的影響（±s，n＝5）

4 討論

AD 是發生于老年群體的原發性神經退行性疾病。我國有超1 000 萬例AD 患者，且隨著老齡化加劇，AD 的發病率不斷上升，預計到2050 年可達到2 800 萬［9］。AD 的病理機制非常復雜，迄今仍不清楚，還未找到有效的治療方案。研究表明飲食因素與AD 的發生有關［10］，例如地中海飲食可降低54%的AD 發生率并降低Aβ 沉積［11］。這些結果突出了飲食干預可能是降低AD 發病率和減緩AD 進展的途徑之一。甜菜堿一直被作為食品添加劑或增色劑使用，無毒副作用，且已有研究報道富含牛磺酸、半胱氨酸、葉酸、甜菜堿的飲食能降低AD 的潛在發病風險［12］。APP/PS1 小鼠是目前國內外較公認且研究最深入的AD 轉基因模型鼠之一［13］。本研究結果顯示，甜菜堿補充飲食可改善APP/PS1 小鼠的記憶功能障礙，此與前人的研究一致。AD 的主要病理特征為多個腦區出現過度沉積的Aβ 斑塊［14］，APP/PS1 小鼠APP基因突變導致Aβ 過度沉積［13］。本研究用免疫熒光實驗證明了甜菜堿補充飲食可降低APP/PS1 小鼠海馬和皮質中Aβ 沉積。以上結果表明，甜菜堿補充飲食是潛在的減緩AD 進展的治療策略。

AD 患者海馬區是腦內神經元易受損傷和突觸可塑性影響的主要腦區之一。成年海馬DG 區存在神經干細胞，其位于海馬門區與顆粒細胞層間的下顆粒帶，并且終生保持著增殖分化的能力［15］。DG 的神經發生在AD 疾病中有著重要作用，AD 患者腦內新生神經元明顯減少［15］。本研究結果顯示甜菜堿補充飲食可明顯增加APP/PS1 小鼠海馬中神經發生和增殖。另外，突觸功能障礙和缺失與AD 中海馬神經功能發生缺陷以及Aβ 進行性堆積有關［16］。棘突是與另外一個神經元突起的終末支和樹突形成突觸的接觸點。本研究顯示，甜菜堿補充飲食可明顯增加APP/PS1 小鼠海馬神經中棘突密度。LTP 被認為是在大腦中儲存記憶的一種突觸機制［17］。因此，甜菜堿補充飲食增強LTP 可以解釋APP/PS1 小鼠的突觸恢復和行為改善的結果。海馬內的突觸結構或/和功能障礙是AD 認知功能嚴重受損的原因之一，而增強海馬神經元突觸可塑性可改善神經元傳導功能和認知功能［18-20］。本研究顯示，攝食甜菜堿后，APP/PS1小鼠海馬中突觸可塑性相關的重要蛋白標記物PSD-95、SYN 和MAP-2 也呈現出增加的趨勢，這些結果表明甜菜堿補充飲食可以挽救突觸損傷。

另外，本研究采用的甜菜堿劑量設定參考文獻［6-7］報道劑量范圍的IC50值，而在進行本實驗時候未設置劑量梯度，這使得本研究具有一定的缺陷。因此，今后仍需通過不同的AD 模型并選擇多種劑量梯度來考察甜菜堿補充飲食對AD 的影響。

綜上所述，盡管本研究還存在一定的局限性，但目前結果顯示甜菜堿補充飲食可改善APP/PS1 小鼠記憶功能受損，并減少海馬和皮質中淀粉樣斑塊沉積，增加海馬神經發生和突觸可塑性，提示了甜菜堿補充飲食將可能是具有前景的AD 飲食方案。