雞血藤總黃酮對大鼠腎缺血再灌注損傷氧化應激及炎癥反應的影響

賴 雯，范路梅，徐祖清，于 晴，靳文鵬，丁兆義

（深圳市龍華區中心醫院重癥醫學科，廣東 深圳 518110）

腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是指腎組織缺血并重新獲取血流灌注后使原有損傷進一步加重的現象，在腎移植排斥與急性腎衰竭的發病中具有重要意義，并與多種慢性腎臟疾病的進展關系密切，但目前臨床尚缺少有效緩解腎IRI 的策略［1-2］。雞血藤具有保護肝臟損傷、降血糖、抗病毒、抗腫瘤、促進造血功能等多種藥理作用，黃酮類化合物是雞血藤的重要功效成分之一［3-4］。研究發現，雞血藤總黃酮能減輕腦缺血模型大鼠腦水腫，降低缺血區面積及丙二醛（malonaldehyde，MDA）水平，并提高超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 等抗氧化物酶活性［5］，但其對腎缺血或腎IRI 模型是否具有保護作用未見報道。在乙醇所致的小鼠肝損傷模型中，雞血藤總黃酮可以通過降低氧化應激水平發揮抗肝損傷作用［6］； 在大鼠慢性不可預知應激誘導的抑郁模型中，雞血藤總黃酮能通過抑制炎癥反應減輕抑郁癥狀［7］。由此推測雞血藤總黃酮對腎IRI 具有潛在的防治效果［8］。本研究通過建立大鼠腎IRI 模型，探討雞血藤總黃酮保護大鼠腎IRI 的作用及其與氧化應激、炎癥反應的關聯性，為其用于腎IRI 的防治提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑 雞血藤（產地云南） 購自藥材市場，經深圳市龍華區中心醫院藥學部張志威副主任藥師鑒定為豆科植物密花豆SatholobussuberectusDunn 的藤莖，經50%乙醇提取、分離，通過聚酰胺樹脂精制，最終獲得雞血藤總黃酮 （質量分數≥85.0%）。血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr） 檢測試劑盒（批號ml076479、ml059735，上海酶聯生物科技有限公司）； MDA、過氧化氫酶（catalase，CAT）、SOD 檢測試劑盒（批號TW30294、TW30805、TW30284，上海通蔚實業有限公司）； 腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素-6 （interleukin 6，IL-6）、IL-10 檢測試劑盒（批號20210726、20211103、20211024，武漢博士德生物工程有限公司）； 細胞核/細胞漿蛋白抽提試劑盒（批號20196ES60，上海翊圣生物技術有限公司）； 兔抗鼠核因子E2 相關因子2 （nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1 （heme oxygenase 1，HO-1）、核因子κB p65 （nuclear factor κB p65，NF-κB p65）、β-肌動蛋白（β-actin）、組蛋白H3 （Histone H3） 抗體 （批號sc-722、sc-390991、sc-8008、sc-8432、sc-517385，美國Santa Cruz 公司）； 辣根酶標記的羊抗兔IgG 抗體（批號211217，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 動物 SPF 級雄性SD 大鼠50 只，體質量200～220 g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （滬） 2019-0002］，飼養于廣州吉妮歐生物科技有限公司［實驗動物使用許可證號SYXK （粵） 2022-0298］，自由飲水與攝食，模擬晝夜環境，每12 h 更換1次光照條件，保持室溫25 ℃。動物處死后各項指標檢測工作在本院中心實驗室進行。本研究嚴格按照3R 原則給予實驗動物人道關懷，研究方案經本院實驗動物倫理委員會審批通過（倫理號GDY2102490）。

1.3 儀器 RM2016 型切片機（德國Leica 公司）； DYS40型顯微鏡（上海點應光學儀器有限公司）； MR-96A 型酶標儀（南京貝登醫療股份有限公司）； XCell SureLock Mini-Cell 型蛋白電泳系統（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 SD 大鼠適應性飼養3 d，根據體質量分為假手術組、模型組及雞血藤總黃酮低、中、高劑量組（40、80、160 mg/kg），每組10 只，雞血藤總黃酮給藥劑量參考文獻［5］ 報道并結合預實驗結果； 假手術組及模型組大鼠灌胃給予蒸餾水，每天1 次，灌胃體積為20 mL/kg，共給藥7 d。

2.2 腎IRI 模型復制 通過無創動脈夾夾閉雙側腎蒂法復制腎IRI 模型［9］。末次給藥1 h 后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg） 麻醉，用手術剪刀在大鼠腹正中處剪2 cm 左右切口，暴露雙側腎蒂后，利用無創動脈夾夾閉阻斷血流供應0.5 h，松開動脈夾使血流供應恢復，完成血流的再灌注，并將切口縫合； 假手術組無動脈夾夾閉操作，其余操作相同。

2.3 BUN 及Scr 水平檢測 術后24 h，腹主動脈采血，離心分離血清，在－80 ℃冰箱中保存備用。分別采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法、肌氨酸氧化酶法檢測大鼠血清BUN 及Scr 水平。

2.4 腎組織病理變化觀察 取各組大鼠部分腎組織，依次經固定、包埋、切片及蘇木精伊紅 （hematoxylin eosin，HE） 染色后，觀察腎組織病理變化。

2.5 氧化應激及炎癥反應指標檢測 取于－80 ℃冰箱中凍存的血清及腎組織（腎組織需進行勻漿后分離取上清液），按照試劑盒說明書，采用酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠血清及腎組織MDA 水平、CAT、SOD 活性等氧化應激指標和TNF-α、IL-6、IL-10 水平等炎癥反應指標。

2.6 Western blot 法檢測腎組織Nrf2、HO-1、NF-κB p65 蛋白表達 各組大鼠腎組織在冰上用高速勻漿器進行勻漿，按照試劑盒說明書分別提取總蛋白、核蛋白及漿蛋白，取等量蛋白與上樣緩沖液混合后，煮沸變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移至硝酸纖維素膜，用脫脂牛奶封閉2 h，TBST 緩沖液漂洗，分別與Nrf2 （1 ∶500）、HO-1（1 ∶500）、NF-κB p65 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶1 000）、Histone H3 （1 ∶1 000） 抗體在4 ℃下孵育過夜，TBST 緩沖液漂洗，加入IgG 二抗（1 ∶2 000） 在室溫下繼續孵育2 h，TBST 緩沖液漂洗，在暗室中用化學發光法顯影，拍照后用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.7 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清BUN 及Scr 水平的影響 如表1 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清BUN及Scr 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠血清BUN 及Scr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），表明雞血藤總黃酮可以改善腎IRI 大鼠的腎臟功能。

表1 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清BUN 及Scr 水平的影響（±s，n＝10）

表1 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清BUN 及Scr 水平的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）BUN/（μmol·L－1）Scr/（μmol·L－1）假手術組—15.44±2.3692.05±12.74模型組—69.52±8.80??316.29±57.21??雞血藤總黃酮低劑量組4051.30±6.25＃＃265.42±34.38＃雞血藤總黃酮中劑量組8038.83±5.49＃＃228.61±29.33＃＃雞血藤總黃酮高劑量組16030.97±4.02＃＃173.18±25.47＃＃

3.2 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織病理變化的影響 假手術組大鼠腎組織形態正常，無變性及壞死情況，腎小管上皮細胞形態飽滿，腎小管管腔無擴張； 模型組大鼠腎組織出現嚴重損傷，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹及脫落，腎小管管腔擴張，炎癥細胞浸潤明顯，腎間質充血、水腫； 雞血藤總黃酮各劑量組大鼠腎組織損傷程度減輕，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹緩解，腎小管管腔擴張情況有所改善，炎癥細胞浸潤及腎間質充血、水腫情況減少，其中雞血藤總黃酮高劑量組作用最為顯著，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化（HE 染色，×200）

3.3 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清MDA 水平及CAT、SOD 活性的影響 如表2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清MDA 水平升高（P＜0.01），CAT、SOD 活性降低（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠血清MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），CAT、SOD 活性升高（P＜0.01）。

表2 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清MDA 水平及CAT、SOD 活性的影響（±s，n＝10）

表2 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清MDA 水平及CAT、SOD 活性的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）MDA/（nmol·mL－1）CAT/（U·mL－1）SOD/（U·mL－1）假手術組—3.61±0.5896.37±14.82184.09±23.95模型組—6.52±0.84??39.80±5.77??97.85±11.06??雞血藤總黃酮低劑量組405.69±0.71＃55.65±7.36＃＃114.32±14.47＃＃雞血藤總黃酮中劑量組804.76±0.57＃＃76.11±9.23＃＃156.13±19.82＃＃雞血藤總黃酮高劑量組1604.20±0.69＃＃88.46±10.31＃＃168.72±17.54＃＃

3.4 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織MDA 水平及CAT、SOD 活性的影響 如表3 所示，與假手術組比較，模型組大鼠腎組織MDA 水平升高（P＜0.01），CAT、SOD 活性降低（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠腎組織MDA 水平降低（P＜0.01），CAT、SOD 活性升高（P＜0.01）。

表3 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織MDA 水平及CAT、SOD 活性的影響（±s，n＝10）

表3 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織MDA 水平及CAT、SOD 活性的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）MDA/（nmol·mg－1）CAT/（U·mg－1）SOD/（U·mg－1）假手術組—4.80±0.63187.75±23.95343.51±45.69模型組—9.69±1.26??87.23±10.53??156.60±19.05??雞血藤總黃酮低劑量組407.02±0.95＃＃128.42±15.40＃＃180.12±21.81＃＃雞血藤總黃酮中劑量組806.15±0.82＃＃159.33±18.79＃＃221.29±25.37＃＃雞血藤總黃酮高劑量組1604.72±0.54＃＃170.98±21.76＃＃269.38±30.23＃＃

3.5 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清TNF-α、IL-6 及IL-10水平的影響 如表4 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清TNF-α、IL-6 及IL-10 水平的影響（±s，n＝10）

表4 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠血清TNF-α、IL-6 及IL-10 水平的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）TNF-α/（pg·mL－1）IL-6/（pg·mL－1）IL-10/（pg·mL－1）假手術組—142.08±17.8172.36±9.78103.78±12.71模型組—395.60±44.24??203.21±25.29??61.51±8.28??雞血藤總黃酮低劑量組40276.45±30.15＃＃170.12±22.26＃69.11±9.20＃雞血藤總黃酮中劑量組80243.26±28.46＃＃137.29±15.87＃＃88.29±12.64＃＃雞血藤總黃酮高劑量組160189.73±21.69＃＃114.77±13.12＃＃95.84±10.37＃＃

3.6 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織TNF-α、IL-6 及IL-10 水平的影響 如表5 所示，與假手術組比較，模型組大鼠腎組織TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠腎組織TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.01），IL-10 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織TNF-α、IL-6 及IL-10 水平的影響（±s，n＝10）

表5 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織TNF-α、IL-6 及IL-10 水平的影響（±s，n＝10）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）TNF-α/（pg·g－1）IL-6/（pg·g－1）IL-10/（pg·g－1）假手術組—1674.01±195.17561.46±65.43868.61±109.36模型組—3785.40±424.95??1627.58±188.26??543.09±62.40??雞血藤總黃酮低劑量組402911.29±314.53＃＃1383.84±152.76＃＃612.47±71.74＃雞血藤總黃酮中劑量組802489.27±307.66＃＃1142.11±148.08＃＃649.85±86.84＃＃雞血藤總黃酮高劑量組1602056.45±226.32＃＃950.23±123.41＃＃727.93±75.09＃＃

3.7 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織Nrf2 及HO-1 蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2 及HO-1 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠腎組織Nrf2 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），中、高劑量組HO-1 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），低劑量組HO-1 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），見圖2、表6。

圖2 各組大鼠腎組織Nrf2 及HO-1 蛋白條帶圖

表6 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織Nrf2 及HO-1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

表6 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織Nrf2 及HO-1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）Nrf2/β-actinHO-1/β-actin假手術組—0.73±0.100.94±0.12模型組—0.11±0.02??0.26±0.04??雞血藤總黃酮低劑量組400.20±0.04＃0.28±0.03雞血藤總黃酮中劑量組800.37±0.05＃＃0.39±0.06＃雞血藤總黃酮高劑量組1600.52±0.07＃＃0.67±0.08＃＃

3.8 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織細胞核與細胞漿中NF-κB p65 蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腎組織細胞核NF-κB p65 蛋白表達升高（P＜0.01），細胞漿NF-κB p65 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，雞血藤總黃酮各劑量組大鼠腎組織細胞核NF-κB p65 蛋白表達降低（P＜0.01），細胞漿NF-κB p65 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖3、表7。

圖3 各組大鼠腎組織NF-κB p65 蛋白條帶圖

表7 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織細胞核與細胞漿中NF-κB p65 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

表7 雞血藤總黃酮對腎IRI 大鼠腎組織細胞核與細胞漿中NF-κB p65 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

注： 與假手術組比較，??P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別劑量/（mg·kg－1）細胞核NF-κB p65/Histone H3細胞漿NF-κB p65/β-actin假手術組—0.32±0.040.89±0.11模型組—0.93±0.10??0.15±0.02??雞血藤總黃酮低劑量組400.48±0.06＃＃0.23±0.03＃雞血藤總黃酮中劑量組800.35±0.05＃＃0.31±0.04＃＃雞血藤總黃酮高劑量組1600.26±0.03＃＃0.38±0.04＃＃

4 討論

氧化應激被認為是導致腎IRI 的主要發病機制之一。缺血再灌注損傷后，腎組織產生大量氧自由基，使氧化應激水平升高，引起腎組織功能障礙、炎性反應、細胞萎縮甚至凋亡［10］。在腎IRI 發生過程中，MDA 水平增加，CAT、SOD 活性降低，氧化應激水平升高； 三七莖葉皂苷、羅格列酮等藥物對大鼠腎IRI 的保護作用均與降低MDA 水平，增加CAT、SOD 活性，進而抑制氧化應激反應有關［11-12］。雞血藤總黃酮也可以抑制心肌組織MDA 水平的升高和SOD活性的降低，在大鼠心肌缺血模型中同樣表現出了抗氧化活性［13］。Nrf2/HO-1 信號通路在機體調控氧化應激反應中占據關鍵位置，對于保護腎IRI 具有重要意義［14］。Nrf2 是作用最強的抗氧化應激調控因子，能夠促進抗氧化酶HO-1的轉錄和表達，減輕氧化應激水平，改善腎IRI［15］。研究發現，刺五加注射液能夠激活腎IRI 大鼠Nrf2/HO-1 信號通路，降低氧化應激水平，減輕腎臟功能損傷［16］。積雪草苷同樣具有保護腎IRI 作用，其機制與激活Nrf2/HO-1 信號通路、增加SOD 活性、降低MDA 水平等有關［17］。本研究同樣發現，雞血藤總黃酮可以降低模型大鼠血清及腎組織MDA 水平，增加CAT、SOD 活性，同時也可以升高模型大鼠腎組織Nrf2 及HO-1 蛋白表達，表明其可以通過活化Nrf2/HO-1 信號通路發揮抗氧化應激作用。

炎癥反應是腎IRI 發生的重要因素，可以引起一系列的病理級聯反應，抑制炎癥反應是避免或減輕腎IRI 的關鍵［18］。地奧司明可減少腎IRI 病理過程中促炎因子TNF-α、IL-6 的釋放，增加抗炎因子IL-10 的釋放，抑制炎癥反應，減輕腎IRI，發揮保護腎臟功能的作用［19］。姜黃素預處理也能減輕腎IRI 大鼠腎組織損傷，并改善腎臟功能，該作用與提高腎組織中IL-10 水平及降低TNF-α、IL-6 水平有關［20］。當腎IRI 發生時，腎組織氧化應激水平升高，NFκB 被活化發生核轉位，使下游的TNF-α、IL-6 等促炎因子表達增加，進一步加重腎缺血再灌注部位的損傷［21］。研究發現，抑制NF-κB 活化，阻止NF-κB p65 的核轉位，有助于維持腎組織正常形態，減輕腎IRI 的炎癥反應，進而發揮腎臟保護作用［22］。既往研究證實，雞血藤總黃酮在體內外均具有較好的抗炎作用［23］。本研究同樣發現，雞血藤總黃酮可以降低模型大鼠血清及腎組織中TNF-α、IL-6 水平，升高IL-10 水平，具有抗炎作用； 進一步研究發現，雞血藤總黃酮預處理后，腎組織細胞核NF-κB p65 蛋白表達降低，細胞漿NF-κB p65 蛋白表達增加，雞血藤總黃酮具有阻止NF-κB p65 核轉位的作用。

綜上所述，雞血藤總黃酮可以改善腎缺血再灌注損傷大鼠的腎臟功能，減輕腎組織病理變化，具有保護大鼠腎缺血再灌注損傷作用，該作用與活化Nrf2/HO-1 信號通路，阻止NF-κB p65 核轉位，進而降低氧化應激水平及抑制炎癥反應有關。