五味子多糖對2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗及AMPK/Nrf2/TXNIP 通路的影響

劉枘岢，胡園園，李雯翀，陳毅光

（1.東莞市松山湖中心醫院內分泌代謝科，廣東 東莞 523326； 2.華中科技大學協和深圳醫院內分泌代謝科，廣東 深圳 518052）

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，其特征是胰島素分泌不足或對胰島素代謝作用的敏感性降低。近年來，2 型糖尿病（T2DM） 的患病率在世界范圍內不斷增加，到2045 年將有大約6.29 億人患T2DM［1-2］。雖然當前的一些治療策略可改善T2DM，但它們的副作用和耐受仍不能忽視。五味子是木蘭科植物的果實，含有多糖、木脂素等活性成分［3-4］，具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、改善血糖等活性，能降低T2DM 大鼠炎癥相關因子腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 和空腹血糖（FBG） 水平，提高空腹胰島素水平和糖耐量，緩解胰島素抵抗［5］。胰島素抵抗是T2DM 的決定性因素［1］，炎癥會促進胰島素抵抗［6］。然而，關于五味子多糖改善胰島素抵抗的作用機制尚不清晰。單磷酸腺苷激活蛋白酶（AMPK） 在能量轉換、葡萄糖代謝、脂肪代謝等過程中發揮作用，激活AMPK 相關通路對于改善T2DM 小鼠機體炎癥反應、脂質代謝、胰島素抵抗具有積極作用［7］。AMPK 磷酸化可促進核因子E2 相關因子2（Nrf2） 激活，降低硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP） 表達，抑制機體炎癥反應［8］。本研究旨在探究五味子多糖治療糖尿病的可能作用機制，以期為臨床治療糖尿病提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級Wistar 健康雄性大鼠，購于省醫學實驗（廣東） 動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK （粵）2018-0002，鼠齡6 周左右，體質量（170±10） g。分籠飼養，12 h/12 h 晝夜交替，溫度25 ℃，相對濕度50%，保持環境清潔。研究遵循“3R” 原則并經東莞市松山湖中心醫院動物倫理委員會批準（倫理號2020-0410）。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素 （ STZ）、AMPK 抑制劑dorsomorphin （批號T1507、T1977） 購于上海陶素生化科技有限公司； 五味子多糖（純度≥95%，批號RH704002）購于上海融禾醫藥科技發展有限公司； TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒，HE 染色試劑盒，BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（批號PT516、PI328、PI303、C0105S、P0012S） 購于上海碧云天生物科技有限公司； 大鼠胰島素ELISA 試劑盒、高效RIPA 裂解液（批號SEKR-0033、R0010） 購于北京索萊寶科技有限公司； 兔源AMPK、Nrf2、TXNIP、NLRP3、GAPDH 一抗、羊抗兔IgG 二抗（批號ab32047、ab137550、ab188865、ab263899、ab8245、ab133470） 購于英國Abcam 公司。

1.3 儀器 小動物血糖測試儀（上海玉研科學儀器有限公司）； BX61 顯微鏡（日本Olympus 公司）； XElx-800 酶標儀（美國Perkin Elmer 公司）； 1659001 蛋白電泳儀、Trans-Blot Wistar 轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）； GIS-500 凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）。

2 方法

2.1 造模 Wistar 大鼠50 只，隨機選取10 只為對照組（常規飼料喂養）； 另40 只構建T2DM 大鼠模型［9］，喂養高脂高糖飼料（63.9% 普通飼料、20% 蔗糖、10% 豬油、5%蛋黃粉、1%膽固醇、0.1%豬膽汁酸鈉），喂養8 周后腹腔注射25 mg/kg STZ，72 h 后尾靜脈取血，以FBG＞7.1 mmol/L、餐后2 h 血糖（P2BG） ＞11.1 mmol/L 為造模成功。造模過程中出現大鼠死亡或不符合條件的現象，及時挑選備用大鼠進行造模處理。

2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機分為模型組、五味子多糖組、AMPK 抑制劑組、五味子多糖＋AMPK 抑制劑組，五味子多糖組大鼠每天灌胃給予100 mg/kg 五味子多糖［10］，AMPK 抑制劑組大鼠每天腹腔注射20 mg/kg AMPK抑制劑dorsomorphin［11］，五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠在灌胃給予五味子多糖后腹腔注射dorsomorphin，連續4周，模型組及對照組大鼠給予等體積生理鹽水。

2.3 大鼠FBG、P2BG 檢測 分別在給藥前、給藥第2 周、給藥第4 周，大鼠禁食12 h，取其空腹尾靜脈血，檢測FBG、P2BG。

2.4 大鼠胰島素抵抗相關指標檢測 末次給藥結束后禁食12 h，取尾靜脈血，靜置20 min 后低溫離心15 min，取血清，按相關試劑盒說明書操作，用ELISA 法檢測血清胰島素水平，計算胰島素敏感指數（ISI），公式為ISI ＝ln ［1/（血清胰島素水平×FBG） ］。

每組取4 只大鼠用于胰島素耐量檢測，上午禁食4 h后，腹腔注射胰島素0.5 U/kg，在注射后30、60、90 min尾靜脈取血檢測血糖水平。

2.5 HE 染色觀察大鼠胰腺組織病理損傷 每組取6 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛后處死，剖開腹腔，分離胰腺，用生理鹽水清洗，部分冷凍保存備用； 部分置于10%多聚甲醛中固定48 h，將胰腺組織經過脫水、透明處理后包埋于融化的石蠟中，待其凝固后修剪成合適形狀并切成厚度約4 μm 的切片，行HE 染色，按相關試劑盒說明書操作，封片、干燥后于光學顯微鏡下觀察。

2.6 ELISA 法檢測大鼠血清炎癥因子水平 取“2.4” 項下各組大鼠尾靜脈血清，按相關試劑盒說明書操作，檢測TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

2.7 Western blot 法檢測大鼠胰腺組織AMPK/Nrf2/TXNIP通路相關蛋白表達 取于－80 ℃冰箱保存的大鼠胰腺組織，加入RIPA 組織裂解液制成勻漿，提取胰腺組織總蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度并定量，高溫加熱變性后電泳分離蛋白質，轉膜后5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入兔源一抗p-AMPK （1 ∶2 000）、AMPK （1 ∶2 000）、Nrf2 （1 ∶500）、TXNIP （1 ∶1 000）、NLRP3 （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入辣根過氧化物標記的二抗，孵育1 h，TBST 洗滌后顯色、定影，以GAPDH 為內參，對各組條帶進行分析，計算蛋白相對表達量。

2.8 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 五味子多糖對T2DM 大鼠FBG、P2BG 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05）； 給藥第2 周、第4 周，與對照組比較，模型組大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，五味子多糖組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠FBG、P2BG 水平降低（P＜0.05），AMPK 抑制劑組大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05）； 與五味子多糖組比較，AMPK 抑制劑組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠FBG、P2BG 水平升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠FBG、P2BG 水平比較（mmol/L，±s，n＝10）

表1 各組大鼠FBG、P2BG 水平比較（mmol/L，±s，n＝10）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與五味子多糖組比較，△P＜0.05。

組別FBG P2BG給藥前給藥第2 周給藥第4 周給藥前給藥第2 周給藥第4 周對照組5.30±1.015.07±0.955.21±1.086.48±1.156.32±1.176.29±1.13模型組19.49±3.06?16.05±2.54?16.06±2.38?22.23±3.46?17.96±3.45?16.98±2.54?五味子多糖組19.50±3.038.18±1.06＃6.97±1.34＃22.38±3.369.49±1.96＃9.03±1.68＃AMPK 抑制劑組19.68±3.6119.44±3.43＃△ 18.97±2.60＃△ 22.03±3.1522.68±3.23＃△22.90±3.53＃△五味子多糖＋AMPK 抑制劑組 19.24±2.8812.36±1.94＃△ 10.18±1.16＃△ 22.30±3.0514.76±1.98＃△13.30±1.68＃△

3.2 五味子多糖對T2DM 大鼠胰島素抵抗相關指標的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清胰島素、血糖水平升高（P＜0.05），ISI 值降低（P＜0.05）； 與模型組比較，五味子多糖組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠血清胰島素、血糖水平降低（P＜0.05），ISI 值升高（P＜0.05），AMPK 抑制劑組大鼠血清胰島素、血糖水平升高（P＜0.05），ISI 值降低（P＜0.05）； 與五味子多糖組比較，AMPK 抑制劑組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠血清胰島素、血糖水平升高（P＜0.05），ISI 值降低（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 各組大鼠血糖水平比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清胰島素水平及ISI 比較（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清胰島素水平及ISI 比較（±s，n＝10）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與五味子多糖組比較，△P＜0.05。

組別血清胰島素/（mIU·L－1）ISI 值對照組56.89±5.58－5.69±0.18模型組75.21±7.38?－7.08±0.28?五味子多糖組62.40±6.10＃－6.07±0.25＃AMPK 抑制劑組83.31±8.44＃△－7.37±0.33＃△五味子多糖＋AMPK 抑制劑組68.50±6.82＃△－6.54±0.32＃△

3.3 五味子多糖對T2DM 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，五味子多糖組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低（P＜0.05），AMPK 抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）； 與五味子多糖組比較，AMPK 抑制劑組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較（μmol/L，±s，n＝10）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較（μmol/L，±s，n＝10）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與五味子多糖組比較，△P＜0.05。

組別TNF-αIL-6IL-1β對照組149.93±11.2358.19±5.1042.20±5.79模型組199.60±15.67?99.38±10.74?142.49±19.74?五味子多糖組168.08±12.38＃68.20±6.13＃82.48±14.07＃AMPK 抑制劑組225.06±16.83＃△112.06±12.30＃△171.35±18.24＃△五味子多糖＋AMPK 抑制劑組181.84±12.06＃△86.30±10.34＃△100.38±11.27＃△

3.4 五味子多糖對T2DM 大鼠胰腺組織形態學的影響 正常組大鼠胰腺組織結構完整，胰島內細胞數量多，細胞排列致密均勻，無明顯病變； 與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織受損較嚴重，胰島形態不規則，胰島細胞胞質減少，一些胰島細胞還在細胞質中表現出液泡變性，炎癥細胞浸潤明顯； AMPK 抑制劑組胰腺組織損傷程度較模型組加重，胰島細胞空泡變性和炎癥細胞增多； 與模型組比較，五味子多糖組大鼠胰腺逐漸恢復，胰島細胞內細胞質明顯增多，空泡變性和炎癥細胞浸潤減少； 與五味子多糖組比較，五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠胰腺組織損傷加重，較多胰島細胞空泡變性，炎癥細胞浸潤增加，見圖2。

圖2 各組大鼠胰腺組織HE 染色（×200）

3.5 五味子多糖對T2DM 大鼠胰腺組織AMPK、Nrf2、TXNIP 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織Nrf2 蛋白表達、p-AMPK/AMPK 比值降低（P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，五味子多糖組和五味子多糖＋AMPK 抑制劑組大鼠胰腺組織Nrf2 蛋白表達、p-AMPK/AMPK 比值升高 （P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表達降低（P＜0.05），AMPK 抑制劑組大鼠胰腺組織Nrf2 蛋白表達、p-AMPK/AMPK 比值降低（P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與五味子多糖組比較，AMPK 抑制劑組和五味子多糖＋AMPK抑制劑組大鼠胰腺Nrf2 蛋白表達、p-AMPK/AMPK 比值降低（P＜0.05），TXNIP、NLRP3 蛋白表達升高（P＜0.05），見表4、圖3。

圖3 各組大鼠胰腺組織AMPK/Nrf2/TXNIP 通路相關蛋白條帶圖

表4 各組大鼠胰腺組織AMPK、Nrf2、TXNIP 蛋白表達比較（±s，n＝3）

表4 各組大鼠胰腺組織AMPK、Nrf2、TXNIP 蛋白表達比較（±s，n＝3）

注： 與對照組比較，?P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與五味子多糖組比較，△P＜0.05。

組別p-AMPK/AMPKNrf2/GAPDHTXNIP/GAPDHNLRP3/GAPDH對照組1.40±0.231.43±0.240.24±0.040.22±0.04模型組0.38±0.07?0.41±0.08?0.95±0.18?0.94±0.16?五味子多糖組0.94±0.16＃0.96±0.15＃0.36±0.06＃0.40±0.08＃AMPK 抑制劑組0.23±0.06＃△0.25±0.05＃△1.31±0.20＃△1.38±0.22＃△五味子多糖＋AMPK 抑制劑組0.61±0.12＃△0.64±0.11＃△0.59±0.12＃△0.61±0.11＃△

4 討論

近年來，T2DM 發病率呈現持續升高趨勢，具有高致殘率和高致死率。T2DM 發病機制復雜，其中胰島素抵抗是主要病因之一，已知氧化應激、炎癥反應等是胰島素抵抗發生的重要機制。高脂飲食及小劑量注射STZ 是目前常用的構建大鼠T2DM 模型的方法［8］，本研究采用此方法成功構建T2DM 大鼠模型，顯示高脂高糖飼料喂養及STZ 可使大鼠產生高血糖、胰腺組織受損、胰島素抵抗、炎癥反應等多種不良影響。

近年來，天然活性物質在T2DM 的治療中具有積極作用，并得到國內外學者的廣泛關注［12-13］。五味子是木蘭科植物，其成熟的果實中含有木脂素、揮發油、多糖等活性成分，具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖等作用［14］。多糖是五味子的重要生物活性成分，多項研究表明五味子多糖具有改善血糖的作用，能緩解胰腺組織病變，降低大鼠血糖水平［15］。Jin 等［16］研究顯示，五味子多糖可通過AMPK 途徑改善大鼠肝細胞中葡萄的糖消耗，并參與預防和緩解胰島素抵抗。本研究結果顯示，五味子多糖治療的大鼠胰腺組織損傷得到一定緩解，大鼠FBG、P2BG 以及血清胰島素、炎癥因子水平降低，ISI 值升高，提示五味子多糖可改善T2DM 大鼠的血糖水平、胰腺組織損傷、胰島素抵抗及炎癥反應，對于治療T2DM 具有一定的價值。

AMPK/Nrf2/TXNIP 通路與糖尿病、炎癥反應聯系密切，AMPK 是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與調控胰島素抵抗、葡萄糖代謝、脂肪代謝，在T2DM、肥胖等代謝類疾病中低表達［6，17］。多項研究表明，激活AMPK 相關通路在改善T2DM 小鼠胰島素抵抗［7］、調節糖尿病肝糖原代謝［18］中發揮重要作用。Nrf2 為核轉錄因子，提高Nrf2 表達可預防T2DM 并發癥，并發揮抗炎作用。TXNIP 調控NLRP3 炎癥小體和促炎因子，降低TXNIP 表達可抑制NLRP3 激活，從而降低TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎癥因子水平，磷酸化的AMPK 可促進Nrf2 激活并抑制TXNIP 表達，對于抑制炎癥反應具有積極意義［19-21］。本研究結果顯示，T2DM 大鼠胰腺組織p-AMPK/AMPK、Nrf2 蛋白表達較對照組降低，TXNIP、NLRP3 蛋白表達升高，經過五味子多糖治療后，大鼠胰腺組織 p-AMPK/AMPK、Nrf2 蛋白表達升高，TXNIP、NLRP3 蛋白表達降低； 并且在五味子多糖干預的基礎上，使用AMPK 抑制劑可減弱五味子多糖對T2DM 大鼠胰島素抵抗的改善作用，表明五味子多糖具有一定的激活AMPK/Nrf2 通路，抑制TXNIP、NLRP3 表達的作用。以上結果提示五味子多糖可能通過調控AMPK、Nrf2，抑制TXNIP 發揮抗糖尿病作用。

綜上所述，五味子多糖對T2DM 大鼠胰島素抵抗有一定的緩解作用，可能是通過激活AMPK/Nrf2/TXNIP 通路實現，但相關機制復雜，是否有其他通路間接參與介導，仍需深入研究。