五汁飲褐變抑制工藝優化

周瑋玲，李燕燕，邱 菁，趙淋仙，徐純藝，胡慧玲，游 宇

（成都中醫藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137）

褐變現象是指產品中的多酚、糖、氨基酸等成分經一系列復雜反應后，生成褐色素物質的現象，會嚴重損害產品外觀及有效成分含量［1］。因此，抑制褐變、保全產品活性或營養成分、控制產品質量一直是含鮮品的中藥產品、食品及相關領域所關注的重點。

五汁飲源自《溫病條辨》，由梨、荸薺、藕、鮮蘆根、鮮麥冬5 味鮮品組成，具有養陰生津、清熱止渴之功，可解熱、止渴、生津［2-3］，方中多酚、多糖等成分是該方發揮藥效作用的重要物質基礎［4-5］，但目前相關研究較少［6-8］。預實驗發現，五汁飲極易發生褐變現象，其整體顏色變暗并朝紅黃方向演變，推測其所含的糖類、酚類成分是參與褐變反應的關鍵物質，同時鮮品提取液中難以去除的不溶性組分（果膠等） 對其也有催化作用［9］，不利于后續制劑、藥效學研究，故控制褐變現象、優化前期制備工藝對保護該方藥效成分、控制其整體質量尤為重要。本實驗優化五汁飲褐變抑制工藝，以期為該方進一步開發應用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 H/T20M 臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）； RE-52AA 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）； Ci7XX0 色差儀［愛色麗（上海） 色彩科技有限公司］； BSA124S 電子分析天平［萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； PS-100A 超聲清洗機（深圳潔康超聲波清洗器有限公司）； 煎藥鍋（潮州市一壺百飲電器實業有限公司）； UV-3300 紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）； JYL-C93T 榨汁攪拌機（山東九陽股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 果膠酶（批號02220905，酶活性60 000 U/g，食品級，和氏璧生物科技有限公司）；L-半胱氨酸（批號20211128，食品級，河北華陽生物科技有限公司）；D-異抗壞血酸鈉（批號20211120，食品級，江西省德興市百勤異VC 鈉有限公司）； 植酸（批號20211206，食品級，桐鄉鑫洋食品添加劑有限公司）； 氯化鈣 （ 批號20211217，食品級，江蘇科倫多食品配料有限公司）； 檸檬酸（批號20211211，食品級，濰坊英軒實業有限公司）； β-環糊精（批號20211228，食品級，孟州市華興生物化工有限責任公司）； 山梨酸鉀（批號20211115，食品級，山東昆達生物科技有限公司）。沒食子酸對照品（批號21012903，純度≥99%，成都普菲德生物技術有限公司）； 福林酚（生物級，上海麥克林生化科技有限公司）； 無水碳酸鈉 （分析純，成都市科隆化學品有限公司）。鮮麥冬 （無硫） 購于四川綿陽 （批號20220622），鮮蘆根購于河南南陽 （ 批號20220614），經成都中醫藥大學龍飛副教授鑒定為正品； 藕購于湖北洪湖； 荸薺購于安徽蕪湖； 皇冠梨購于河北。

2 方法與結果

2.1 復合褐變抑制劑配比優化

2.1.1 褐變抑制率測定 前期實驗研究表明，五汁飲在第7 天后褐變反應趨于平穩，故本實驗考察抑制劑在7 d 內對整體顏色的保護作用。根據課題組前期研究結果制備五汁飲，選取新鮮、大小均勻、無病蟲害、無機械損傷的梨70 g、荸薺30 g、藕20 g，去皮，切塊，榨汁，過濾，4 ℃、5 000 r/min 離心20 min，取上清液； 取麥冬5 g、蘆根8 g，加入10 倍量蒸餾水浸泡30 min 后武火煮沸，再用文火煎煮60 min，合并3 次濾液，濃縮，冷卻至室溫，將上清液和濾液合并，純水定容至100 mL，即得，在4 ℃下放置7 d。選擇25 mm 孔徑板、透射模式對Ci7XX0 色差儀進行黑白校準，測定亮度值（L?）、紅綠值（a?）、黃藍值（b?），計算褐變指數、褐變抑制率［10-11］，公式分別為褐變指數＝ ［（X－0.31） ×100］ /0.172 ［X＝ （a?＋1.75×L?） /（5.645×L?＋a?－3.012×b?） ］、褐變抑制率＝ ［（BIX1－BIX2） /（BIX1－BIX0） ］ ×100% （BIX0、BIX1、BIX2分別為對照品第0 天、對照品第7 天、樣品第7 天的褐變指數）。

2.1.2 單因素試驗 根據文獻［12-14］ 報道及前期預實驗結果，選擇檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、β-環糊精、植酸、L-半胱氨酸作為抑制劑，以褐變抑制率為評價指標考察其抑制作用。其中，L-半胱氨酸屬于天然抗酶促褐變物質，對褐變反應有較強的抑制作用［15］，將其用量水平設定為0.30% ～0.50%； 植酸具有抗氧化功能，可清除活性氧，同時螯合易于催化氧化反應的二價陽離子（Fe2＋、Cu2＋等）［16］，將其用量水平設定為0.1% ～0.3%； 氯化鈣是多酚氧化酶（PPO） 活性抑制劑，其所含的鈣離子與PPO 結合后可降低后者活性，從而抑制酶促褐變［17］，將其用量水平設定為0.01% ～0.05%；D-異抗壞血酸鈉用量水平設定為0.25% ～0.45%； β-環糊精是PPO 活性抑制劑，其內部空腔會與底物形成包合物組織酶后發生反應，從而發揮抑制作用［18］，將其用量水平設定為0.20% ～0.40%； 檸檬酸有3 個羧基，能有效絡合體系中的Fe2＋、Cu2＋等金屬離子，控制其催化氧化反應［19］，但其酸性較強，用量過高時會影響順應性［20］，將其用量水平設定為0.60% ～0.75%。結果見圖1。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results for single factor tests

2.1.3 Plackett-Burman 試驗 以L-半胱氨酸（A）、檸檬酸（B）、植酸（C）、氯化鈣（D）、D-異抗壞血酸鈉（E）、β-環糊精（F） 用量為影響因素，褐變抑制率（Y） 為評價指標，結果見表1。再采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表1 數據進行回歸分析，得方程為Y＝80.19 ＋0.50A－0.63B＋0.66C＋0.44D＋0.60E－0.40F，方差分析見表2，可知檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉、植酸用量有顯著影響（P＜0.05）。

表1 Plackett-Burman 試驗設計與結果Tab.1 Design and results for Plackett-Burman tests

表2 Plackett-Burman 試驗方差分析結果Tab.2 Results for analysis of variance for Plackett-Burman tests

2.1.4 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗、Plackett-Burman 試驗基礎上結合 《GB 2760-2014食品添加劑使用標準》［21］，采用Design Expert 8.0軟件，以植酸（A）、檸檬酸（B）、D-異抗壞血酸鈉（C） 用量為影響因素，褐變抑制率（Y） 為評價指標，因素水平見表3，結果見表4。

表3 Box-Behnken 響應面法因素水平（Ⅰ）Tab.3 Factors and levels for Box-behnken response surface method （Ⅰ）

表4 Box-Behnken 響應面法設計與結果（Ⅰ）Tab.4 Design and results for Box-Behnken response surface method （Ⅰ）

采用Design Expert 8.0 軟件對表4 數據進行回歸分析，得方程為Y＝89.31－0.88A－0.57B＋0.94C－ 0.078AB－ 0.012AC－ 0.34BC－ 1.73A2＋0.15B2－1.75C2，方差分析見表5。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明模型失擬項不顯著； 相關系數R2為0.857 8，表明模型能解釋85.78%響應值的變化，可用于預測分析。

表5 Box-Behnken 響應面法方差分析結果（Ⅰ）Tab.5 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method （Ⅰ）

響應面分析見圖2。由此可知，各因素之間存在一定正向交互作用，表現為簡單非線性關系； 因素A、C、A2、C2有顯著影響（P＜0.05）； 各因素影響程度依次為C＞A＞B。最終確定，最優配比為植酸用量0.015%，檸檬酸用量0.75%，D-異抗壞血酸鈉用量0.34%，預測褐變抑制率為90.06%。

圖2 各因素響應面圖（Ⅰ）Fig.2 Response surface plots for various factors （Ⅰ）

2.2 酶解澄清工藝優化 五汁飲含有大量花青素類成分，在貯存過程中易受溫度、光照等因素影響形成不溶性沉淀物，高速離心法、醇沉法均不能將其完全去除。課題組前期研究表明，果膠酶可有效去除不溶性組分，故本實驗選擇其作為酶解試劑。

2.2.1 多酚含量測定 參照文獻 ［22］ 報道，采用福林酚法。取0.1 mL 樣品，置于10 mL 量瓶中，加入0.5 mL 福林酚試劑、1.5 mL 15%Na2CO3溶液，充分混勻，蒸餾水定容至刻度，75 ℃水浴15 min，在760 nm 波長處測定吸光度，平行3 次。以吸光度為縱坐標（A），對照品質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，得方程為A＝82.607X－0.007 4（R2＝0.999 4），在0.000 ～0.007 mg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.2 出膏率測定 取20 mL 樣品，放到干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，置于105 ℃干燥箱中干燥3 h，每隔1 h 稱定質量直至恒重，計算出膏率，公式為出膏率＝ （干膏質量/藥材質量×稀釋倍數） ×100%。

2.2.3 澄清度測定 參考文獻［23］ 報道，以蒸餾水為空白凋零，取澄清后樣品，在680 nm 波長處測定吸光度A，計算透光率T（即澄清度），公式為A＝－lgT。

2.2.4 Box-Behnken 響應面法 采用Design Expert 8.0 軟件，以果膠酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C） 為影響因素，綜合評分（Y） 為評價指標，因素水平見表6，結果見表7。

表6 Box-Behnken 響應面法因素水平（Ⅱ）Tab.6 Factors and levels for Box-behnken response surface method （Ⅱ）

表7 Box-Behnken 響應面法設計與結果（Ⅱ）Tab.7 Design and results for Box-Behnken response surface method （Ⅱ）

采用Design Expert8.0 軟件對表7 數據進行回歸分析，得方程為Y＝89.41－0.42A＋2.59B＋0.27C＋0.79AB＋1.15AC＋0.48BC－0.64A2－1.18B2－0.17C2，方差分析見表8。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項P＞0.05，表明模型失擬項不顯著； 相關系數R2為0.919 2，表明模型能解釋91.92% 響應值的變化，可用于預測分析。

表8 Box-Behnken 響應面法方差分析結果（Ⅱ）Tab.8 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method （Ⅱ）

響應面分析見圖3。由此可知，各因素之間存在一定正向交互作用，其中B、B2、AC有顯著影響（P＜0.05）； 各因素影響程度依次為B＞A＞C。最終確定，最優工藝為果膠酶用量0.23%，酶解溫度54.13 ℃，酶解時間135 min，預測澄清度為80.95%，出膏率為8.11%，多酚含量為0.389 5 mg/mL，綜合評分為91.28 分。

圖3 各因素響應面圖（Ⅱ）Fig.3 Response surface plots for various factors （Ⅱ）

2.2.5 權重系數確定

2.2.5.1 AHP 法 將澄清度、多酚含量、出膏率作為指標，結合預實驗和文獻［24］ 報道擬定其重要性依次為澄清度＞多酚含量＝出膏率，構建優先判斷矩陣，見表9。結果，上述指標權重系數分別為0.448 15、0.294 44、0.257 41，CR ＝0.018＜0.10，表明三者權重具有一致性。

表9 各指標優先判斷矩陣Tab.9 Priority judgment matrices for various indices

2.2.5.2 CRITIC 法 將數據進行無量綱化處理，即X′ij＝ （Xj－Xmin） /（Xmax－Xmin），并按如下公式計算指標權重，結果見表10。

表10 CRITIC 權重計算結果Tab.10 Results for CRITIC weight calculation

2.2.5.3 AHP-CRITIC 復合加權法 在“2.2.5.1”“2.2.5.2” 項基礎上計算綜合權重W綜合ij［25］，公式為。結果，澄清度、多酚含量、出膏率綜合權重分別為0.428 6、0.363 5、0.207 9。

2.2.5.4 綜合評價 分別采用AHP 法、CRITIC法、AHP-CRITIC 復合加權法進行綜合評價，結果見表11，可知3 種賦權方法所得綜合評分接近。再采用SPSS 26.0 軟件對上述結果進行相關性分析，測得AHP 法與AHP-CRITIC 復合加權法之間的相關系數為0.978，CRITIC 法與AHP-CRITIC 復合加權法之間的相關系數為0.936，AHP 法與CRITIC 法之間的相關系數為0.853，均有顯著性差異（P＜0.05），但在權重系數方面，AHP 法與CRITIC 法之間的相關系數為－0.316，無顯著差異（P＞0.05），表明兩者所展示的信息無疊加，即AHP-CRITIC 復合加權法更科學合理。

表11 3 種賦權方法綜合評分（分）Tab.11 Comprehensive scores for three weighting methods （score）

2.3 驗證試驗

2.3.1 復合褐變抑制劑配比 按“2.1.1” 項下方法制備3 批樣品，按“2.1.4” 項下優化配比添加復合褐變抑制劑，在4 ℃下放置7 d 后測定褐變抑制率，結果見表12。由此可知，平均褐變抑制率為89.54%，與預測值90.06% 接近（相對偏差為0.52%），表明該配方穩定可靠，可有效抑制褐變。

表12 復合褐變抑制劑配比驗證試驗結果（n＝3）Tab.12 Results for verification tests for proportion of composite browning inhibitors （n＝3）

2.3.2 酶解澄清工藝 按“2.1.1” 項下方法制備3 批樣品，按“2.2.4” 項下優化工藝酶解澄清，測定多酚含量、出膏率、澄清度，計算綜合評分，結果見表13。由此可知，平均綜合評分為91.42 分，與預測值91.28 分接近（相對偏差為0.77%），表明該工藝穩定可靠，可有效去除不溶物，并保留有效成分。

表13 酶解澄清工藝驗證試驗結果（n＝3）Tab.13 Results for verification tests for enzymatic hydrolysis and clarification process （n＝3）

2.3.3 整體工藝評價 僅添加復合褐變抑制劑時，樣品在貯存后第2 天即出現大量沉淀，搖之不散；在酶解澄清前不添加復合褐變抑制劑時，樣品酶解后褐變指數顯著升高，樣品整體上呈棕褐色； 先添加復合褐變抑制劑再酶解澄清時，樣品顏色均一穩定，室溫下放置72 h 無沉淀，褐變指數未明顯升高，表明兩者共同發揮抑制褐變的作用。

3 討論

3.1 復合褐變抑制劑篩選 研究表明，天然植物和真菌提取物具有抑制褐變的潛力［26-29］，但其制備工藝復雜，難以應用于工業化大生產。目前，控制產品褐變的常用方法為添加復合褐變抑制劑，可針對褐變反應不同機制發揮單一或復合的抑制作用［12-19］。本實驗在前期文獻查閱、市場調研的基礎上結合藥品、食品相關法規要求，采用Box-Behnken 響應面法優化復合抑制劑配伍，得到最優組成為0.015%植酸，0.75%檸檬酸，0.34%D-異抗壞血酸鈉，可有效緩解五汁飲褐變。

3.2 澄清工藝篩選 研究表明，不溶性組分對褐變反應進程具有促進作用［9］。課題組前期發現，合適的澄清工藝對阻止褐變進程具有積極意義，而果膠酶可有效去除五汁飲中不溶性成分； 本實驗在此基礎上，采用AHP-CRITIC 復合加權法結合Box-Behnken 響應面法優化酶解澄清工藝，得到最優工藝為0.23%果膠酶，酶解時間135 min，酶解溫度55 ℃，可有效去除五汁飲中的不溶物，與復合褐變抑制劑共同抑制褐變反應進程。

4 結論

本實驗首先采用Box-Behnken 響應面法對相關數據進行建模，對因素不同水平進行分析，再通過AHP-CRITIC 復合加權法進行權重設計，篩選復合褐變抑制劑配方，優化酶解澄清工藝參數，最終得到最優五汁飲褐變抑制工藝。驗證試驗表明，所得結果真實可靠，工藝穩定可行，可為后續相關產品開發奠定基礎。