石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦體系降解四氯化碳

劉喬丹， 李 輝， 劉勇弟

（1.華東理工大學資源與環境工程學院, 上海 200237；2.上海大學環境與化學工程學院, 上海 200444）

鐵呼吸是生態系統中常見的一類微生物代謝方式。鐵還原菌可以通過呼吸作用在厭氧條件下氧化自身的基質，然后把電子轉移至細胞外的三價鐵氧化物并將其還原為二價鐵，鐵還原菌可以從反應中獲取能量從而進行代謝生長[1-2]，而高價鐵氧化物被還原后容易在其表面形成吸附態的Fe(ⅠⅠ)[3]，吸附態Fe(ⅠⅠ)容易與其他離子反應生成次生鐵礦，這些次生鐵礦有較高的氧化還原電位，容易對氯代有機物進行降解[4-7]。作為常見的氯代有機物，四氯化碳由于使用范圍廣、不易自然降解、毒性強、且容易在土壤和地下水中留存，因而對人體健康以及生態系統造成影響。而利用微生物修復技術降解地下水中的氯代有機物是一種可應用于原位修復、二次污染較少的技術[8]，目前對于鐵還原菌的鐵還原體系還原降解四氯化碳的研究已有較多相關報道[9-10]。

鐵還原菌的還原過程本質上是電子傳遞[11]，即鐵還原菌利用外部碳源等物質將電子傳遞給胞外電子受體的過程。利用鐵還原菌對氯代有機物進行降解的過程包括生物和非生物過程，其中的生物過程，即鐵還原菌胞外電子傳遞的過程和方式是關鍵步驟[12]。鐵還原菌胞外電子傳遞通常是多種方式并用[13]，胞外電子穿梭體的存在能促進鐵還原菌的電子傳遞效率[14-18]。而石墨烯作為炭基材料，有著極強電學性質和較高的比表面積[19-21]，并且石墨烯表面含有醌類和半醌類的官能團，因此具有較強的接受電子以及給出電子的能力，可作為電子穿梭體提髙電子傳遞的速度[22-23]。近年來，生物炭等一些炭基材料作為電子穿梭體可以加強鐵還原菌還原鐵氧化物的機制[24-25]，逐漸被人們研究。然而，目前對石墨烯材料作為鐵還原菌和鐵氧化物電子穿梭體機制的研究比較缺乏。

本文以四氯化碳為對象，研究石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦體系在還原脫氯過程中的作用，從污染物反應動力學、石墨烯介導作用機制出發，研究石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦體系還原四氯化碳的效果和機理。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

雙氧水（H2O2），w=30%，上海凌峰化學試劑有限公司；四氯化碳（CCl4），分析純，國藥集團化學試劑上海有限公司；戊二醛，分析純，北京百靈威科技有限公司；還原氧化石墨烯（rGO），分析純，上海中科納米有限公司；氧化石墨烯（GO），分析純，上海中科納米有限公司；鐵還原菌Shewanella putrefaciensCN32(CN32)，中國海洋微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實驗儀器

恒溫培養箱，BPC-250F，上海一恒科學儀器有限公司；真空冷凍干燥機，CY0-0.4，北京惠誠佳儀科技有限公司；X 射線電子能譜儀（XPS），ESCALAB 250XⅠ，賽默飛世爾科技公司；傅里葉紅外光譜儀，Nicolet 6700，賽默飛世爾科技公司；X 射線衍射儀（XRD），D/Max-2550PC，日本株式會社理學公司；氣相色譜儀，GC-2014C，島津（中國）有限公司；紫外/可見分光光度計，UV-1800，島津（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同石墨烯的制備與表征

（1）石墨烯的改性。用雙氧水對rGO 粉末進行處理，具體步驟：將0.5 g rGO 粉末添加至30 mLw=30% H2O2的溶液中，在燒杯中攪拌15 h，然后在烘箱中于90 ℃下加熱45 min。冷卻洗凈后，在轉速7 500 r/min 條件下離心8 min，去掉上清液，用冷凍干燥機干燥后備用，并命名為rGO（H2O2）。

（2）石墨烯的表征。采用傅里葉紅外光譜儀對3 種不同石墨烯的官能團種類進行分析；采用XPS定量分析3 種石墨烯不同官能團的含量以及不同元素的價態。采用比表面儀測定3 種石墨烯的比表面積和粒徑等物理參數。

1.3.2 石墨烯初始濃度的確定 在110 mL 血清瓶中分別加入2、4、10 mL 質量濃度為0.5 g/L 的rGO，在反應體系中加入30 mmol/L 乳酸鈉、3 mL CN32 菌液、0.5 g 針鐵礦以及20 mmoL 的N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）作生物緩沖劑以維持體系pH在7.0 左右，最后通入無菌氮氣使體系保持厭氧狀態。將血清瓶置于30 ℃、150 r/min 的恒溫搖床中反應。設置2 個對照組，一組只加入相同菌種及針鐵礦（控制組1），另一組是加入相同菌種和針鐵礦后經過高溫滅菌的空白對照（控制組2）。

1.3.3 石墨烯對鐵還原體系的影響與電化學表征

（1）石墨烯對鐵還原體系的影響。使用110 mL棕色血清瓶為反應容器，反應體系為30 mmol/L 乳酸鈉、3 mL CN32 菌液、0.5 gα-FeOOH、2.5 mL 20 mg/L 的3 種石墨烯（GO，rGO，rGO（H2O2））。然后加入20 mmol的HEPES 和無菌無機鹽培養基以便將體系的pH 維持在7.0 左右，最后通入無菌氮氣使體系處于厭氧條件。密封避光置于30 ℃、150 r/min 的恒溫搖床中反應，對照組設置情況同1.3.2 節。定期用針筒取樣，采用比色法測定溶液中溶解態Fe(ⅠⅠ)濃度以及總Fe(ⅠⅠ)濃度，并以總Fe(ⅠⅠ)濃度減去溶解態Fe(ⅠⅠ)濃度得到體系中吸附態Fe(ⅠⅠ)的濃度。

（2）鐵還原生成次生鐵礦的分析。反應結束后，將血清瓶中液體離心后冷凍干燥，采用XRD 分析石墨烯耦合鐵還原反應后的鐵氧化物的晶體形態以及是否有新的次生鐵礦產生。

（3）石墨烯電子交換容量的測定。不同炭基材料的電子交換容量（EEC）主要是由材料表面擁有的氧化還原基團數量決定的，包括苯醌、羥基醌、羧基和酚基[26]，其中最主要的是醌基。通過介導電化學還原(MER)和介導電化學還原氧化(MEO)方法，測定石墨烯表面基團的氧化還原能力，從而在一定程度上表征不同石墨烯的電子轉移能力。

通過電流計時法分別獲得石墨烯氧化態及還原態的電流（I）-時間（t）曲線，并通過式（1）和式（2）計算不同石墨烯的電子接受容量（EAC）和電子供給容量（EDC）：

其中：Ired為基線校正后的氧化還原電流，A；F為法拉第常數，96 485.3 C/mol；m為加入的石墨烯的質量，g。

石墨烯還原態的電流-時間曲線和氧化態的電流-時間曲線的測定方法為：先將5 mLGO 超聲分散，制備成GO 懸浮液，并取0.5 mL 加入到玻璃皿中，然后加入PBS（0.1 mol/L Na3PO4，0.1 mol/L KCl，pH=7.0），并通氮氣去除溶液中氧氣。將電化學工作站與三電極連接，打開時間電流模式，并將工作電極的電位設置為?0.55 V(vs.SHE，SHE 即標準氫電極)，分別以相同步驟再次測定rGO 和rGO(H2O2)的電流-時間曲線。測定氧化態的電流-時間曲線時，將工作電極電位設置為+0.71 V，其余步驟相同。

1.3.4 石墨烯對耦合體系降解四氯化碳的影響 脫氯實驗使用110 mL 棕色血清瓶，體系內含30 mmol/L乳酸鈉、3 mL 的CN32 菌液、0.5 g 針鐵礦，體系內GO、rGO、rGO(H2O2) 3 種石墨烯質量濃度均為20 mg/L，CCl4的濃度為40 μmol/L，加入20 mmoL 的HEPES和無菌無機鹽培養基以便將體系的pH 維持在7.0 左右，最后通入無菌氮氣使體系處于厭氧條件。密封避光放于30 ℃、150 r/min 的恒溫搖床中反應，設置2 個對照組，一個為不加入石墨烯但加入相同菌種及針鐵礦的等條件對照組，另一個為不加針鐵礦和石墨烯但加菌種的條件對照組。采用氣相色譜儀測定樣品中的四氯化碳濃度。

2 結果與討論

2.1 不同石墨烯的官能團表征

圖1 為GO、rGO、rGO(H2O2) 3 種石墨烯的紅外光譜圖。由圖可知在3 425 cm?1處不同石墨烯均有較寬的吸收峰，表明石墨烯表面均含有羥基官能團。在1 660 cm?1處3 種石墨烯均顯示有C＝ O 官能團的峰出現，其中rGO 的峰值最大，而在1 097 m?1處出現的吸收峰代表的是石墨烯中C?O 鍵產生的振動。rGO(H2O2)相比于rGO，C＝ O 鍵和C?O 鍵的峰值降低了，表明rGO(H2O2)的碳氧官能團含量相對減少。

圖1 不同石墨烯的紅外光譜圖Fig.1 FT-ⅠR Spectra of different prepared graphene

研究表明石墨烯的電子轉移能力與其C/O 質量比相關[27]。采用XPS 進一步驗證不同石墨烯表面官能團的結構，不同石墨烯的C1s 圖譜測試結果如圖2 所示。可以看出在284.12、284.55、285.61、286.05 eV 處分離出4 種主要的官能團的峰，分別對應石墨烯上的C＝ C、C?C/C?H、C?O 以及C＝ O鍵。表1 所示為不同石墨烯官能團質量分數及理化性質的對比。由表1 可知，相比于rGO，rGO(H2O2)中C＝ C 鍵的質量分數降低，且C＝ O 鍵的質量分數也相應減少，表明經雙氧水處理的rGO 中的碳氧官能團含量減少；rGO 的比表面積最大，表明其有較強的吸附性能。

表1 不同石墨烯的官能團質量分數及理化性質Table 1 Mass fraction of functional groups and physicochemical properties of different graphenes

圖2 不同石墨烯的C1s 圖譜分析Fig.2 C1s scan spectra for different GOs graphene

2.2 石墨烯初始質量濃度的確定

研究表明石墨烯對CN32 等鐵還原菌會產生一定程度的毒性影響，而不同石墨烯對鐵還原菌的毒性影響類似[28]。以rGO 為例，研究不同質量濃度對鐵還原過程的影響，結果如圖3 所示。根據圖3 可知，當rGO 質量濃度為20 mg/L 時，rGO 對針鐵礦的還原速率最大。當rGO 質量濃度增大到50 mg/L時，還原速率反而降低了，這表明高質量濃度的rGO不利于CN32 鐵還原過程的進行。因此，選取質量濃度為20 mg/L 的不同石墨烯進行后續的鐵還原實驗。

圖3 rGO 質量濃度對鐵還原過程的影響Fig.3 Effect of the rGO mass concentration on iron reduction process

2.3 石墨烯介導鐵還原菌還原針鐵礦過程解析

2.3.1 石墨烯促進鐵還原菌還原針鐵礦 圖4 所示為不同石墨烯介導的鐵還原體系在反應周期內吸附態Fe(ⅠⅠ)濃度以及總Fe(ⅠⅠ)濃度的變化。從圖4 中可以看出：石墨烯的加入顯著提高了CN32 的鐵還原效率，實驗條件下：加入了20 mg/L GO、rGO 和rGO（H2O2）的反應體系在反應結束后總Fe(ⅠⅠ)濃度分別為0.72±0.05、1.17±0.02 、0.79±0.07 mmol/L，說明rGO的促進效果最好，GO 最弱，而rGO（H2O2）的促進效率相比rGO 降低了約32.5%（（1.17?0.79）/1.17×100%），且對比圖4（a）和圖4（b）可知，不同體系中吸附態的Fe(ⅠⅠ)濃度均占總Fe(ⅠⅠ)濃度70%左右。

圖4 石墨烯介導下耦合體系生成Fe(ⅠⅠ)濃度變化Fig.4 Changes of Fe (ⅠⅠ) concentration in graphene mediated coupling system

2.3.2 鐵還原菌還原針鐵礦生成次生鐵礦分析 圖5所示為有/無石墨烯介導情況下鐵還原菌還原針鐵礦后材料的XRD 圖譜。可以看出在無石墨烯加入的情況下，針鐵礦經過鐵還原菌還原后生成了綠銹，其XRD 圖譜在11.78°，23.67°有特征峰出現。由于實驗體系中含有硫酸根，且綠銹中的鐵化合價包括二價鐵以及三價鐵兩種類型[6]，因此推測得到的綠銹化學結構式為；石墨烯耦合體系下針鐵礦經過鐵還原菌還原后，在10.95°、14.09°、20.05°有特征峰出現，表明生成了藍鐵礦。藍鐵礦主要成分為八水合磷酸亞鐵。由于實驗體系中含有磷酸根，因此推測溶液中的吸附態Fe(ⅠⅠ)可能與磷酸根共沉淀產生了藍鐵礦。

圖5 鐵還原菌還原針鐵礦后材料的XRD 圖譜Fig.5 XRD pattern of the materials after reduction of goethite by ferric reducing bacteria

2.3.3 鐵還原過程電化學分析 EAC 和EDC 之和即為物質的EEC，EEC 越大，則該物質的氧化還原活性越大[26]。圖6 所示為采用計時電流法測定不同石墨烯的EAC 和EDC 的值。由圖6 可以得出，rGO 的氧化還原活性最大，其EEC 值為300.37 μmol/g，而rGO（H2O2）的EEC 值為210.95 μmol/g，相比rGO 降低了29.8%。表明雙氧水的處理會破壞rGO 的一部分醌類基團導致其EDC 和EAC 下降；GO 的氧化還原活性最小，表明其表面含氧官能團中醌類基團數量占比較低，與結構表征的結果一致。

圖6 計時電流法測定石墨烯的EDC 和EACFig.6 EDC and EAC of the graphene tested by chronoamperometry

2.4 石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦降解四氯化碳

2.4.1 石墨烯對鐵還原菌耦合針鐵礦降解四氯化碳的影響 圖7 所示為不同石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦降解四氯化碳動力學。由圖可知，當只有鐵還原菌時在反應期內四氯化碳的濃度幾乎沒有降低，說明單獨鐵還原菌很難降解四氯化碳；鐵還原菌耦合針鐵礦的還原體系相比只有鐵還原菌的對照組，四氯化碳降解率（實驗在第40 d 結束時，四氯化碳濃度變化與其初始濃度的比值）提高了2.87%，表明鐵還原菌耦合針鐵礦體系對四氯化碳有一定的降解作用；在加入石墨烯的體系中，四氯化碳的降解效果顯著提高，其最終降解率在37.5%～92.5%之間。從圖4 鐵還原過程中的吸附態Fe(ⅠⅠ)濃度以及2.3.2節中次生鐵礦的生成可以推測，石墨烯能夠加快鐵還原體系降解四氯化碳的主要原因是形成脫氯活性較強的次生鐵礦，即藍鐵礦。

圖7 石墨烯介導下耦合體系降解四氯化碳動力學Fig.7 Degradation dynamics of CCl4 by graphene mediated coupling system

圖8 所示為脫氯反應的主要中間產物三氯甲烷濃度隨時間的變化曲線，由圖可知，三氯甲烷濃度存在最大值，表明四氯化碳的脫氯過程是逐步進行的，即首先脫氯生成三氯甲烷，三氯甲烷再進一步進行脫氯反應。GO 介導的耦合體系中產生的三氯甲烷濃度最低，最高濃度約為15 μmol/L；rGO 介導的耦合體系中產生三氯甲烷的濃度最高，最高濃度約為31 μmol/L；rGO（H2O2）介導的耦合體系中產生的三氯甲烷最高濃度介于兩者之間，約為26 μmol/L。三氯甲烷產生的濃度與2.3.1 節不同石墨烯介導的耦合體系下產生的吸附態Fe(ⅠⅠ)濃度相對應，表明該體系下產生的吸附態Fe(ⅠⅠ)能一定程度上促進四氯化碳的降解。

圖8 石墨烯介導下耦合體系降解四氯化碳生成三氯甲烷的濃度曲線Fig.8 Concentration curves of CHCl3 generated from CCl4 degradation in graphene mediated coupling system

表2 所示為四氯化碳降解動力學方程的擬合參數。由表2 可知，在rGO 介導的鐵還原菌耦合針鐵礦還原體系下，kobsCT（準一級速率常數）為（0.965±0.004） d?1，約為無石墨烯對照組kobsCT值（0.065±0.006）的14.8 倍。表明石墨烯能有效提高鐵還原菌還原針鐵礦降解四氯化碳的速率。

表2 四氯化碳降解動力學方程的擬合參數Table 2 Fitting parameters of CCl4 degradation kinetic equation

圖9 所示為石墨烯的EEC 與四氯化碳kobsCT的相關性分析。由圖可知，不同石墨烯的電子轉移能力即氧化還原能力與kobsCT值具有很好的線性相關性（R2=0.98），表明石墨烯表面的氧化還原活性官能團數量可能是影響其作為鐵還原菌胞外電子穿梭體能力的主要因素。

圖9 準一級速率常數與石墨烯電子交換容量的相關性分析Fig.9 Correlation analysis between pseudo-first-order-rate constant and electronic exchange capacity of graphene

2.4.2 石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦還原體系降解四氯化碳機理 圖10 所示為石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦還原體系降解四氯化碳的機理。在鐵還原體系中，由于石墨烯具有較大比表面積的特性，其表面會吸附大量的鐵還原菌和針鐵礦，增加了鐵還原菌和針鐵礦的反應位點和幾率。同時石墨烯具有較好的導電能力，其表面的醌基等氧化還原活性基團能以電子穿梭體的形式提高鐵還原菌的電子傳遞效率，從而使得到電子的針鐵礦在石墨烯表面還原產生大量的吸附態Fe(ⅠⅠ)。這些吸附態Fe(ⅠⅠ)在還原體系下再與磷酸根結合生成藍鐵礦，而藍鐵礦對氯代有機物有較高的降解活性[29]。產生的藍鐵礦與被吸附在石墨烯表面的四氯化碳發生了脫氯反應，并使其分解成三氯甲基自由基（·CCl3），·CCl3可以從水分子中提取氫生成三氯甲烷，而吸附態的Fe（ⅠⅠ）失去電子后，則重新被氧化為Fe（ⅠⅠⅠ），從而完成鐵循環反應。另外從圖8 可以看出，在石墨烯介導的3 種耦合體系降解四氯化碳第15 d 時，三氯甲烷的濃度均出現一個最大值，因此推測鐵還原體系下一部分·CCl3可能會被繼續還原為，而直接通過脫去一個Cl?得到。通過OH?*的連續親核攻擊，可以產生CCl(OH)*和，得到水中OH?后脫水生成甲酸鹽產物，而CCl(OH)*通過脫去一個HCl 得到CO[5]。

圖10 石墨烯介導鐵還原菌耦合針鐵礦還原體系降解四氯化碳機理圖Fig.10 Mechanism of CCl4 degradation by graphene mediated iron-reducing bacteria coupled with goethite reduction system

3 結 論

（1）在有石墨烯的鐵還原菌耦合針鐵礦體系中，吸附態Fe(ⅠⅠ)濃度均有所提高，其中rGO 促進程度最大，GO 促進效果最弱，rGO（H2O2）促進效率相比rGO 降低了約32.5%，由表征結果推測體系中生成了具有還原脫氯活性的藍鐵礦。而在未加入石墨烯的鐵還原體系中，表征結果表明僅生成了綠銹，說明吸附態Fe(ⅠⅠ)濃度的提高有助于生成污染物降解活性更大的藍鐵礦。

（2）rGO（H2O2）的EEC 值相比rGO 降低了29.8%，表明雙氧水的處理會破壞rGO 的一部分醌類基團導致其EEC 值下降。

（3）不同石墨烯均能夠作為電子穿梭體提高鐵還原菌耦合針鐵礦降解四氯化碳的速率，且四氯化碳降解的kobsCT和石墨烯EEC 具有較好的相關性，表明石墨烯表面電子傳遞速率決定了四氯化碳還原脫氯速率。