甘蔗糖蜜促進類球紅細菌輔酶Q10 的糖轉化效率

葛 燕， 栗 波， 劉愛軍， 肖慈英， 陳必欽， 朱志春， 梁劍光， 莊英萍， 王澤建

（1.常州大學藥學院, 江蘇 常州 213164；2.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237；3.河北欣港藥業有限公司, 石家莊 051530；4.內蒙古金達威藥業有限公司, 呼和浩特 010000）

輔酶Q10（Coenzyme Q10, CoQ10），是一種親酯性分子，在有氧呼吸的電子傳遞鏈中充當電子載體，產生三磷酸腺苷（ATP），并廣泛存在于生物中[1-2]。輔酶Q10是一種強抗氧化劑，通過直接清除自由基或再生生育酚水平來保護膜磷脂和蛋白質不受脂質過氧化的影響[3]。此外，輔酶Q10在膽固醇代謝、氨基酸代謝、維持溶酶體pH 值等方面發揮作用，已被證明直接影響許多基因的表達[4]。醫學研究表明，補充輔酶Q10對糖尿病患者、心血管衰竭患者以及患有阿爾茲海默癥和帕金森病等神經系統疾病的患者有益[5-7]。

輔酶Q10的生物合成方法具有成本低、生產過程簡單、生物活性較高的特點，被認為是最有前景的方法，主要生產菌株有酵母菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、紅曲酶屬等[8]。輔酶Q10發酵優化策略主要有分子優化策略、氧調控策略和培養基優化策略。Zhu等[9]通過在類球紅細菌中共同表達gpa-1 和vgb 基因，調節了細胞內的氧化還原電位和攝氧量，產生了協同效應，提高了輔酶Q10的產量和生物量，在補料分批發酵中，輔酶Q10產量達到600 mg/L。Wang 等[10]通過調節供氧水平和連續補料硫酸銨，將在線氧攝取速率（OUR）恒定控制在（45±2.2） mmol/(L·h)，輔酶Q10產量達到（2 584±82） mg/L，較對照組提高了15.4%。

培養基優化是提高微生物代謝水平和產物積累較有效的方法[11]，其中碳源和氮源對菌體生長代謝影響較大。甘蔗糖蜜(Cane Molasses，CM)是制糖產業的副產品，其中含有40%～60%的糖(葡萄糖、蔗糖和果糖)，氮含量（質量分數）約為8.7%。此外，甘蔗糖蜜中還含有一定量的氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸），有機酸（蘋果酸、檸檬酸、草酸等），無機鹽（Na+、Mg+、K+、P+等金屬離子）和維生素（膽堿、泛酸、煙酸）等物質，可以為菌體生長提供能量、提供物質合成所需的碳骨架和前體[12-15]。文獻[16]發現甘蔗糖蜜可以作為酵母菌株生長和代謝所必需的碳源，有效提高乙醇的產量。與葡萄糖和其他碳源相比，甘蔗糖蜜中含有大量的糖，是通過生物轉化生產生物產品的廉價原料[17]。Gomes 等[18]利用甘蔗糖蜜中的混合糖來生產丁醇，既降低了原材料的成本，又提高了丁醇的產量。

糖轉化率是影響輔酶Q10產量的關鍵，是生產中的主要組成部分，降低糖消耗量是提升生產效率的關鍵。甘蔗糖蜜能夠用于菌體的生長和能量的維持，實現替代糖的功能，用于菌體的生長且利用效率更高。甘蔗糖蜜具有成本低、污染物含量少、全年可用性等優點，已經被用于乳酸、丁酸、乙醇、檸檬酸等多種工業化產品的生產[19]。Wechgama 等[20]采用正交試驗設計優化了培養基，提高了甘蔗糖蜜生產丁醇的效率，并且使糖轉化率提高到了90.50%，甘蔗糖蜜中含有大量的可發酵糖，有效地降低了生產成本。綜上所述，甘蔗糖蜜的添加有利于生產成本的降低，然而目前鮮有關于甘蔗糖蜜對輔酶Q10發酵的影響的報道，本研究首次考察了甘蔗糖蜜對輔酶Q10發酵的影響。

本文選用類球紅細菌作為出發菌株生產輔酶Q10，首先研究了不同碳源底物、甘蔗糖蜜濃度、玉米漿干粉對類球紅細菌菌體生長和輔酶Q10合成的影響，通過正交試驗優化了甘蔗糖蜜、葡萄糖、磷酸二氫鉀的最佳配比，并在30 L 發酵罐上對甘蔗糖蜜添加工藝進行中試驗證。本文對提高輔酶Q10發酵效價和降低發酵成本具有重要的現實意義。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

1.1.1 菌株 類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides），由內蒙古金達威藥業有限公司提供。

1.1.2 實驗儀器 SBA-40E 型生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）；30 L 發酵罐（上海國強生化工程裝備有限公司）；安捷倫1260 型液相色譜儀（美國Agilent 公司）；MAX300-LG 型尾氣質譜儀（美國Extrel 公司）；752 型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器公司）。

1.1.3 培養基

（1）平板培養基（g/L）：酵母提取物15，磷酸氫二鉀1，氯化鈉2，七水硫酸亞鐵0.1，七水硫酸鎂0.5，硫酸錳溶液（10 g/L）3 mL，氯化鈷溶液（10 g/L）1 mL，氯化膽堿溶液（0.404 g/L）1 mL，瓊脂粉20，pH 7.0～7.2。

（2）種子培養基（g/L）：硫酸銨4，酵母粉2，味精1，玉米漿粉1，葡萄糖15，磷酸氫二鉀1，磷酸二氫鉀1，硫酸亞鐵0.2，硫酸鎂3.6，氯化鈉2，硫酸錳溶液1（0 g/L）2 mL，氯化鈷溶液（10 g/L）1.5 mL，pH 7.1～7.2。

（3）發酵培養基（g/L）：葡萄糖30，硫酸銨3，味精3，玉米漿干粉4，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂12，硫酸亞鐵1.2，氯化鈉2.5，酵母膏1，碳酸鈣2.5，GLT-309 消泡劑0.2 mL。

1.1.4 培養方法

（1）搖瓶培養：從平板上挑取顏色鮮艷、形態飽滿的單菌落接入裝有50 mL 一級種子培養基的500 mL搖瓶中，在32 ℃、260 r/min 下避光培養28 h，按1%接種量將一級種子液接入裝有200 mL 二級種子培養基的2 L 搖瓶中，在32 ℃、260 r/min 培養21 h；按10%接種量將二級種子液接入裝有45 mL 發酵培養基的500 mL 搖瓶中，在32 ℃、260 r/min 下培養48 h。

（2）發酵罐培養：30 L 發酵罐裝液量為20 L，按10%接種量接入到發酵罐中，初始轉速400 r/min，通氣量3 L/min，壓力0.05 MPa，溫度32 ℃，發酵過程中用氨水調控pH 為6.5，補料控制糖質量濃度在（5.0±0.1） g/L，培養96 h，每4～6 h 取樣檢測OD700、菌體干重（DCW）、殘糖、pH、效價等參數，并鏡檢觀察菌體形態變化，每12 h留樣測效價，分別研究甘蔗糖蜜和玉米漿干粉對類球紅細菌產輔酶Q10的影響。

1.2 檢測方法

1.2.1 菌體濃度測定 OD700：取1 mL 發酵液，用去離子水稀釋至合適倍數，一級種子稀釋約20 倍，二級種子稀釋約20～50 倍，發酵液稀釋50～100 倍，使用紫外可見分光光度計在700 nm 波長處測吸光度。DCW：取10 mL 發酵液，在4 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清后，將沉淀放入烘箱，于105 ℃下烘干稱量。

1.2.2 葡萄糖濃度測定 取5 mL 發酵液，在4 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋至合適倍數，吸取25 μL 稀釋液，用葡萄糖測定儀進行檢測。

1.2.3 總糖濃度測定 用DNS（二硝基水楊酸）法測總糖。二硝基水楊酸與還原糖發生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內顏色深淺與還原糖含量成比例。具體操作方法是取離心上清液，按照估計的總糖進行濃度稀釋。混勻后取稀釋液1 mL 加入10 mL離心管，加入750 μL鹽酸和750 μL去離子水，攪拌均勻，沸水浴20 min。水解完畢后，冷卻至室溫，繼續加入750 μL、6 mol/L 的氫氧化鈉溶液，使溶液pH至7.4 左右，加入750 μL 去離子水，1.5 mL DNS 溶液，沸水浴5 min，最后加入4.5 mL 去離子水，混勻。在波長540 nm 處檢測吸光度。

1.2.4 輔酶Q10含量測定 通過高效液相色譜法測定發酵液中的輔酶Q10含量，具體色譜條件為：C18 色譜柱（4.6mm×150 mm，5 μm，不銹鋼柱），檢測波長275 nm，流動相為無水乙醇與無水甲醇混合液（乙醇與甲醇體積比為35∶65），進樣量20 μL，流速1.1 mL/min，柱溫35 ℃。

樣品處理方法：避光處理；吸取1 mL發酵液，置于10 mL 容量瓶中，加6 mol/L 鹽酸溶液10 μL，輕微振搖，再加無水丙酮2 mL，φ為30%雙氧水200 μL，用無水乙醇定容至刻度。再將容量瓶置超聲器中超聲提取45 min（容量瓶的塞子放小紙片，排氣、超聲過程水溫不宜過高，35 ℃以下），取出，搖勻。用0.45 μm針筒過濾器過濾，棄去初濾液，收集續濾液，用高效液相色譜儀分析。

1.2.5 糖轉化率（Yp/s） 糖轉化率的計算公式如下：

其中， TiterQ10為輔酶Q10產量，mg/L； ρG0為初始糖的質量濃度, g/L； ρGt為最終糖的質量濃度, g/L；經檢測發酵2 d 培養基體積量揮發較少，可忽略不計。

1.2.6 OUR 檢測 發酵過程中采用質譜儀對OUR進行在線測定，并使用Biostar 軟件對數據進行采集以及在線處理。OUR 的具體計算公式如式（2）：

其中，Fin為進氣流量（mmol/L）；V為發酵液體積（L）；φinert,in, φO2,in, φCO2,in, φO2,out和 φCO2,out分別表示進氣中惰性氣體、氧氣、二氧化碳和尾氣中氧氣、二氧化碳的體積分數，pin為進氣氣壓(Pa)，tin為溫度(℃)，h為進氣的相對濕度(%)。上述變量除tin、h外均由反應器在線參數檢測獲得，tin、h為離線測定所得[21]。

1.2.7 二氧化碳釋放速率（CER）測定 GER 計算公式如式（3）所示：

2 結果與討論

2.1 不同碳源對類球紅細菌Q10 發酵過程的影響

碳源在微生物培養基中具有重要作用，為微生物生長提供物質基礎，并為產物合成提供碳架。不同碳源進入糖酵解所需的酶不同，會影響微生物對碳源的利用效率和產物的轉化效率。因此，本研究考察了不同種類碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖）搖瓶發酵對類球紅細菌生長和輔酶Q10合成的影響，結果如圖1 所示。

圖1 不同碳源對類球紅細菌發酵過程的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation process of Rhodobacter sphaeroides

搖瓶結果（圖1（a））可以看出，單糖更利于類球紅細菌生長，尤其是葡萄糖作為碳源最適合類球紅細菌菌體生長，發酵48 h 葡萄糖組菌體濃度可達到29.00 g/L，輔酶Q10質量濃度292.00 mg/L，單位菌體產量10.07 mg/g（表1）。類球紅細菌對果糖的利用效果低于葡萄糖，這是因為果糖需要先轉化為果糖-6-磷酸，再轉化為葡萄糖-6-磷酸，中間需要果糖激酶等一系列酶催化，導致菌體生長緩慢。從糖耗（圖1（b））可以看出，二糖可以被緩慢利用，但是類球紅細菌對二糖利用效果明顯低于單糖，二糖的菌體濃度只能生長到16 g/L 左右，這是因為二糖水解為單糖需要一系列酶的作用，其中，蔗糖轉化為葡萄糖和果糖需要蔗糖酶，麥芽糖和乳糖分別需要麥芽糖酶和乳糖酶轉化為葡萄糖，而類球紅細菌相關酶的活力較低，導致菌體對糖的消耗比較緩慢，菌體生長缺乏有效碳源，菌體濃度較低，搖瓶內未達到氧限制狀態，而輔酶Q10的合成是在氧限制的條件下，所以二糖組幾乎沒有產物的合成和積累。

表1 葡萄糖組和果糖組發酵參數Table 1 Fermentation parameters of cane molasses group and corn steep powder group

2.2 不同質量濃度甘蔗糖蜜對類球紅細菌發酵過程生理參數影響

本研究將玉米漿干粉（Corn Steep Powder，CSP）全部替換為氮含量相等的甘蔗糖蜜（4 g/L 玉米漿干粉和5 g/L 甘蔗糖蜜中氮的質量濃度基本相等），并研究了不同甘蔗糖蜜質量濃度（5、10、15、20、25、30 g/L）對類球紅細菌生長和輔酶Q10合成的影響，結果如圖2 所示。

圖2 不同質量濃度甘蔗糖蜜對類球紅細菌發酵過程的影響Fig.2 Effects of different mass concentrations of cane molasses on the fermentation process of Rhodobacter sphaeroides

由圖2（a）看出，添加5 g/L 甘蔗糖蜜組和對照組的DCW 皆可達到33 g/L，且添加5 g/L 甘蔗糖蜜組的輔酶Q10產量僅比對照組少3%（圖2（b）），說明甘蔗糖蜜可以替代玉米漿干粉作為類球紅細菌生產輔酶Q10的合適氮源。隨著甘蔗糖蜜添加質量濃度的添加，菌體濃度呈先增長后降低的趨勢，輔酶Q10產量也呈現相同的趨勢。當甘蔗糖蜜添加質量濃度為20 g/L 時，DCW 和輔酶Q10產量均達到最高，分別為35 g/L 和343 mg/L，Q10產量較對照組提高了19.6%。當添加的甘蔗糖蜜質量濃度超過20 g/L 時，輔酶Q10的產量會稍微下降。從菌體的產物得率Yp/c結果（圖2（c））可知，甘蔗糖蜜添加組的Yp/c基本高于對照組，且在低質量濃度糖蜜范圍下Yp/c與對照組相近，而隨著甘蔗糖蜜質量濃度的增加，Yp/c與總效價的變化趨勢相似，先上升后下降，其中，添加20 g/L 甘蔗糖蜜條件下Yp/c達到9.87 mg/g，比對照組高14.2%。由圖2（d）知，添加甘蔗糖蜜有利于糖轉化率的提高，當甘蔗糖蜜添加質量濃度為20 g/L 時，糖轉化率達到最高（6.87 mg/g），較對照組提高了19.6%，葡萄糖得到了高效的利用。

甘蔗糖蜜中的糖類物質可以被菌體利用，為菌體生長提供能量，甘蔗糖蜜中豐富的氮源有利于菌體生長中氨基酸、蛋白質、核酸及含氮代謝物的合成，當添加一定量的甘蔗糖蜜時，有利于促進菌體生長，菌體生長越好，產量就越高。當甘蔗糖蜜添加質量濃度過高時，糖蜜中的金屬離子和其他的微量元素濃度過高會影響菌體生長代謝，進而抑制輔酶Q10的合成。以上實驗證明，輔酶Q10的合成過程中，甘蔗糖蜜質量濃度為20 g/L時最利于菌體生長和產物合成，輔酶Q10的效價和糖轉化率可以得到顯著提高，有效地減少了對葡萄糖的利用，且甘蔗糖蜜價格低廉，可以降低生產成本，適合在生產中使用。

2.3 正交試驗

為探索碳源與氮源及無機鹽組分的最優化搭配，本研究在單因素碳源實驗的基礎上，通過設計正交試驗選取對類球紅細菌產輔酶Q10影響較大的3 個因素：甘蔗糖蜜、葡萄糖、磷酸二氫鉀的質量濃度，考察對輔酶Q10發酵的影響。各因素選取3 個試驗水平，以糖轉化率為考察指標。正交試驗考察結果（表2）直觀數據分析及相應方差統計結果（表3）顯示，葡萄糖質量濃度對輔酶Q10糖轉化率的影響最為顯著（p＜0.05），磷酸二氫鉀的質量濃度對類球紅細菌產輔酶Q10的糖轉化率影響最小。不同因素組合對輔酶Q10的影響和正交試驗的效應曲線分別如圖3和圖4 所示。從菌體干重(圖3(a))及其效應曲線圖(圖4(a))可知，菌體濃度與甘糖蜜和葡萄糖的初始添加量呈正相關，當添加的甘蔗糖蜜質量濃度為30 g/L、葡萄糖質量濃度為70 g/L 時，菌體濃度達到最大，但是隨著葡萄糖質量濃度的增加，耗糖速率也在增加(圖3(d)、4(d))，不利于糖轉化率的提升，增加了生產成本。正交試驗結果(表2)顯示，在 30 g/L 的初始糖質量濃度下，輔酶Q10的糖轉化率最高，達到了 12.71 mg/g；隨著初始糖質量濃度的增加，糖轉化率顯著下降，當初始糖質量濃度為 50 g/L，糖轉化率降到了 7.9 mg/g。甘蔗糖蜜質量濃度影響統計結果顯示(圖3(b)、4(b)、4(c))，甘蔗糖蜜質量濃度對輔酶Q10產量影響較大，20 g/L 為甘蔗糖蜜的最適添加的質量濃度，當添加的質量濃度超過 20 g/L 時，由于甘蔗糖蜜中金屬離子等其他物質的積累，對輔酶 Q10的合成以及糖轉化率的提升沒有促進作用。

表2 正交試驗結果表Table 2 Table of orthogonal experiment results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

圖3 正交試驗中不同組合對輔酶Q10 發酵的影響Fig.3 Effect of different combinations on Coenzyme Q10 fermentation in orthogonal experiment

圖4 正交試驗效應曲線圖Fig.4 Curves of the effects of orthogonal experiments

結合圖4 和表2 可知，最優組合是A2B1C2，即甘蔗糖蜜質量濃度為20 g/L，葡萄糖質量濃度為30 g/L，磷酸二氫鉀質量濃度為1 g/L 時，糖轉化率最高，達到12.71 mg/g，輔酶Q10效價達到380.1 mg/L，糖轉化率得到了較大的提升，且耗糖速率為0.62 g/(L·h)，有效地降低了糖耗，有利于降低生產成本。

2.4 甘蔗糖蜜添加工藝對輔酶Q10 合成的影響

為進一步分析甘蔗糖蜜對輔酶Q10發酵過程動態代謝的影響，結合搖瓶發酵培養基優化實驗結果，在30 L 發酵罐中考察了甘蔗糖蜜對輔酶Q10發酵過程中菌體生長和產物合成的影響，并與玉米漿工藝進行了對比分析。

30 L 發酵罐培養過程在線和離線相關參數的變化（圖5）顯示：在發酵前期，玉米漿干粉組菌體生長較快，且輔酶Q10效價高于甘蔗糖蜜組。在發酵后期（76 h 后），甘蔗糖蜜為氮源能夠更好地維持菌體活力，輔酶Q10合成速率能夠維持，96 h 發酵產量最高達到3 311 mg/g，比玉米漿干粉組高15.4%。OUR 作為能夠直接反應細胞呼吸代謝情況的生理參數，可以體現出發酵過程中菌體生長的狀態。從兩組實驗OUR 變化可以看出（圖5（c））：在發酵60 h 前，甘蔗糖蜜組較平穩，玉米漿干粉組波動較大；在發酵后期，玉米漿干粉組OUR 呈現持續下降的趨勢，而甘蔗糖蜜組能維持較為穩定的OUR 水平，且明顯高于玉米漿實驗組，這說明甘蔗糖蜜的添加明顯起到了維持菌體活力的作用。二氧化碳釋放速率（CER）變化（圖5（d））與OUR 表現出了同樣的趨勢，甘蔗糖蜜組優于玉米漿干粉組，這些都表明甘蔗糖蜜的添加有利于菌體呼吸代謝。從單位產量（圖5（e））和輔酶Q10合成速率（圖5（f））也可以看出，甘蔗糖蜜的添加有利于維持后期菌體活力以及輔酶Q10的合成。通過甘蔗糖蜜組和玉米漿干粉組發酵過程參數的最大值（表4）可看出，與玉米漿相比，甘蔗糖蜜的糖耗（Ys/p）從112.78 kg/kg 降低到99.74 kg/kg，糖轉化率提高了13.9%。糖耗得到顯著降低，這是因為甘蔗糖蜜中含有的還原糖可以被菌體生長利用，從而降低了葡萄糖的消耗，并且提高了發酵后期葡萄糖轉化為輔酶Q10的效率，在提高產量的同時，進一步降低了生產成本。

表4 甘蔗糖蜜組和玉米漿干粉組發酵過程參數的最大值Table 4 Fermentation process maximum parameters of cane molasses group and corn steep powder group

圖5 甘蔗糖蜜組和玉米漿干粉組發酵過程代謝參數差異Fig.5 Difference of metabolic parameters between sugarcane molasses group and corn pulp dry powder group during fermentation

30 L 發酵罐的實驗結果表明，添加甘蔗糖蜜可有效提高輔酶Q10的產量，有利于菌體代謝活力的維持，并能有效提升輔酶Q10對葡萄糖的轉化率。此外，甘蔗糖蜜中含有氨基酸、有機酸、含氮化合物、維生素、K+、甜菜堿等能夠維持菌體的代謝活力，可為輔酶Q10合成提供前體，促進輔酶Q10的合成。

3 結 論

（1）考察了不同碳源對輔酶Q10的影響，發現葡萄糖為碳源最適于菌體生長和輔酶Q10的合成，同時，類球紅細菌可以利用二糖生長菌體，但利用率低于單糖。

（2）首次考察了添加不同質量濃度的甘蔗糖蜜對輔酶Q10發酵的影響，當甘蔗糖蜜添加質量濃度為20 g/L時，輔酶Q10產量達到343 mg/L，糖轉化率提升了19.6%。

（3）通過正交試驗探究了甘蔗糖蜜、葡萄糖、磷酸二氫鉀的質量濃度對類球紅細菌產輔酶Q10的影響，研究結果表明，當甘蔗糖蜜質量濃度為20 g/L、葡萄糖質量濃度為30 g/L、磷酸二氫鉀質量濃度為1 g/L 時，輔酶Q10產量提高了10.8%，且糖轉化率達到12.71 mg/g，較優化前提高了85.0%。

（4）在30 L 發酵罐上考察了糖蜜添加工藝對輔酶Q10合成的影響，研究發現玉米漿干粉有利于前期菌體的生長和輔酶Q10的合成，而甘蔗糖蜜有利于維持菌體代謝活力和輔酶Q10的合成速率，促進后期輔酶Q10的合成，Q10產量最高達到3 311 mg/L，較對照組提高了15.4%，同時糖耗降低了11.8%，糖轉化率為10.10 mg/g，提高了13.9%。

（4）添加一定量的甘蔗糖蜜有利于輔酶Q10的合成和糖轉化率的提升，降低生產成本，為放大生產提供了理論依據。后續可以通過結合代謝物組學和轉錄組學深入研究甘蔗糖蜜在類球紅細菌中的代謝機理，從而更全面深入地了解甘蔗糖蜜對輔酶Q10的發酵影響。