新型PCV2 衣殼融合蛋白在HEK293F 細胞瞬時表達研究

羅清平， 彭 妍， ALⅠ Mohsin， 莊英萍,， 郭美錦,

（1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237；2.上海國佳生化工程技術研究中心有限公司, 上海 200237）

豬圓環病毒2 型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）是引發豬圓環病毒相關性疾病(Porcine Circovirus Associated Disease, PCVAD)的傳染病原[1]，已給全球豬養殖行業帶來了巨大損失。目前已發現8 種亞型如 PCV2a、 PCV2b、 PCV2c、 PCV2d、 PCV2e、PCV2f、PCV2g 和PCV2h[2-3]，其中PCV2b 流行最為廣泛[4]。PCV2 病毒衣殼蛋白是構成病毒外殼結構的唯一結構蛋白，含有中和表位誘導機體產生保護性免疫反應，被廣泛應用于亞單位疫苗開發生產。目前PCV2 亞單位疫苗技術路線主要采用原核生物和桿狀病毒/昆蟲表達系統。現國內外開發上市的多種PCV2 疫苗能夠減少疾病的發生，也造成新病毒株的產生，引起免疫逃逸問題。因此，開發新型PCV2疫苗及探索新的表達方式具有非常重要的意義。

PCV2 衣殼蛋白在多個宿主表達系統中進行了表達研究。采用大腸桿菌[5]和畢氏酵母[6-7]表達全長PCV2 衣殼蛋白時存在難表達問題，在切除蛋白N 端前導序列能夠改善蛋白的表達水平[8]。另外，桿狀病毒/昆蟲系統具有高效表達外源蛋白的表達系統[9-10]，采用pFastBac 載體和Sf9 細胞， 獲得PCV2 衣殼蛋白150 μg/mL 的表達水平[11]。然而，在哺乳動物細胞系統表達PCV2 衣殼蛋白方面研究相對缺乏。瞬時基因表達（Transient Gene Expression, TGE）技術是將外源表達載體瞬時轉染哺乳細胞實現外源蛋白快速表達的方式。由于能夠快速獲取目標蛋白并進行后續蛋白研究，該技術得到廣泛應用[12-15]。盡管存在對一些外源蛋白瞬時表達水平低的問題[16-19]，但有研究報道，采用降低培養溫度、提高培養系統滲透壓、補加蛋白胨添加物，以及細胞本身工程化改造等方式能夠提高外源蛋白瞬時表達水平[20-24]。

本文對不同宿主細胞、轉染試劑、轉染試劑與質粒比例及孵育時間等多個因素進行考察，研究在哺乳動物細胞瞬時表達PCV2 病毒衣殼蛋白對細胞轉染效率的影響。采用電泳阻滯實驗及負染色透射電子顯微鏡方法揭示了混合時間對PEⅠ與DNA形成復合物的電荷與大小存在影響。另外，為了提高PCV2 衣殼蛋白的表達水平以及增強蛋白免疫原性，本文對PCV2 衣殼蛋白進行了工程化改造，設計如下：以免疫逃逸型豬圓環病毒2b 型NDSU41513毒株衣殼蛋白，去除N 端富含堿性氨基酸的41 位氨基酸，并通過鏈接子在C 端與豬源ⅠgG Fc 片段進行連接，設計出新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-Fc(pig)protein（PCFP）分子。在3 L 反應器中對HEK293F細胞進行瞬時轉染，成功實現了PCFP 融合蛋白在哺乳細胞HEK293F 中的表達，為病毒類蛋白在哺乳動物表達系統中的表達和制備提供很好的探索。

1 材料與方法

1.1 目的基因、細胞株、培養基及試劑

實驗采用豬圓環病毒2 型 NDSU41513 毒株編碼的衣殼蛋白基因（GenBank accession number KR 816332.1）。哺乳細胞細胞株HEK293F、Escherichia coliDH5α、質粒pEGFP-N1 和pcDNA3.1（+）來自實驗室保藏。細胞株CHO-K1 由中科院友情提供。限制性內切酶NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ采購自德泰生物科技（南京）有限公司。pfu 酶，T4 DNA 連接酶等購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。25 kDa 和40 kDa線性聚乙烯亞胺轉染試劑 (PEⅠ) 采購自懋康生物技術有限公司。搖瓶中所用培養基為Union 293 培養基，采購自永聯生物科技（上海）有限公司。生物反應器培養中所用培養基為OPM-293 CD05 培養基，采購自上海奧浦邁生物科技有限公司。純化及電泳分析所用試劑采購自碧云天生物科技有限公司。兔抗衣殼蛋白多克隆抗體一抗采購自美國Abcam 公司。HRP 標記的山羊抗兔抗體二抗采購自艾美捷科技有限公司。完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑采購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。商業化抗PCV2 亞單位疫苗（CSV）采購自青島易邦生物工程有限公司。商業化小鼠（Mouse）圓環病毒2 型抗體（PCV-2-Ab）試劑盒采購自江蘇菲亞生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

蛋白純化儀（美國GE 公司，AKTA explorer）；攪拌式生物反應器（中國上海國強生化工程裝備有限公司，FAS-3L 型）；細胞培養自動控制系統軟件（中國上海國強生化工程裝備有限公司，V2.0 版本）； PCR（Polymerase Chain Reaction）核酸擴增儀（中國北京東勝創新生物科技有限公司）；超凈工作臺（中國蘇州博訊儀器有限公司，ETC811 型）；透射電子顯微鏡（日本電子株式會社，JEM-1400 型）；超聲破碎儀（美國Misonix 公司，QsonicaLLCQ125 型）；CountStar 細胞計數儀(中國上海睿鈺生物科技有限公司，MD F4 型)；葡萄糖乳酸生化分析儀（中國山東省科學院生物研究所，SBA-40E 型）

1.3 實驗方法

1.3.1 載體構建 構建pEGFP-N1-Capid 載體。以豬圓環病毒2 型 NDSU41513 毒株編碼的衣殼蛋白基因（GenBank accession number KR816332.1）為基礎，進行密碼子優化， DNA 序列通過化學合成克隆到pUC57 載體（德泰生物科技有限公司）。在pUC57-Capsid 載體中，通過pEGFP-N1-Capid（PENC）引物用pfu 酶PCR 擴增出PCV2 衣殼蛋白基因片段（表1）。PCR 擴增反應條件為：95 ℃、3 min（95 ℃、25 s，66 ℃、20 s，72 ℃、40 s） 25 循環，72 ℃、1 min。使用TianGen純化試劑盒（天根生化科技北京有限公司），回收PCR 擴增目標片段DNA，將回收PCR 產物與空載體pEGFP-N1 分別進行NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ酶雙酶切，處理后使用T4 DNA 連接酶連接，構建載體pEGFP-N1-Capid。構建pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）載體。Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）基因序列是由PCV2衣殼蛋白基因通過鏈接子Linker（GSGGGSGGGG SGGGS）與豬血清免疫球蛋白G（ⅠgG）重鏈Fc 區域基因（序列ⅠD 為Gen Bank accession number AAD 38418.1）連接構成。表達的蛋白為PCFP 融合蛋白。同樣將經密碼子優化的Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）序列通過化學合成克隆到pUC57 載體上。通過帶有NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ酶切位點的pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）（PDCF）引物（表1），PCR 擴增出Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）基因片段。回收的擴增產物與空載體pcDNA3.1（+）DNA 分別進行限制性內切核酸酶NheⅠ和Hind ⅠⅠⅠ酶雙酶切。T4 DNA 連接酶連接，構建重組質粒pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）。

表1 實驗所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3.2 細胞培養及轉染表達方法 在搖瓶中進行培養。將懸浮HEK293F 細胞和CHO-K1 細胞接種在含有HT 的Union 293 培養基中，置于37 ℃、85%濕度、φ=5.0%二氧化碳、100 r/min 轉速的搖床中培養。細胞在對數生長階段，細胞活率超過95%細胞擴增。細胞轉染時，DNA 質量濃度為1 mg/L，PEⅠ（Polyethylenimine）濃度依實驗要求設定，將PEⅠ和DNA 按照相同體積進行混和，室溫下靜置30 min。將配制的PEⅠ/DNA 復合物加入到細胞密度約為1.0 ×106cells/mL 待轉染細胞（HEK293F 或CHO 細胞）中。將細胞置于37 ℃、φ=5.0%二氧化碳、90 r/min轉速的二氧化碳恒溫搖床中進行培養。流加培養模式為補加葡萄糖，維持葡萄糖質量濃度為2～5 g/L。在3 L 生物反應器中對HEK293F細胞進行培養。將裝1.2 L OPM-293 CD05 培養基的反應器的攪拌轉速設定為120 r/min，溫度維持在37 ℃，pH 控制在7.0±0.1，溶解氧濃度為50%。當活細胞密度為2.0×106cells/mL 時，以質量濃度2 mg/L pcDNA3.1(+)-PCV2 Capsid(△1-41aa) –Fc(pig)質粒，將PEⅠ-40kDa與質粒按照質量分數比6∶1 進行混合，孵育30 min后，瞬時轉染HEK293F細胞。每天補加葡萄糖，維持葡萄糖質量濃度為2～5 g/L。

1.3.3 融合蛋白純化 細胞生物反應器培養結束后離心收獲細胞，將細胞濕重與pH7.4 的磷酸緩沖液按質量體積比1∶8 重懸，超聲破碎。收集上清，0.22 μm膜過濾。同樣，對細胞培養上清液，經0.22 μm 膜過濾收集進行親和層析純化。系統用平衡液以流速為4 mL/min 平衡10 個以上柱體積，然后將樣品（流速為1.0 mL/min）進行上樣至完成。使用0.1 mol/L 甘氨酸（pH 為3.0）的洗脫液進行洗脫，收集洗脫組分。使用1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5 中和液，以體積比1∶10中和洗脫組分。

1.3.4 核酸瓊脂糖電泳鑒定 配制1.0%（10 g/L）并添加有10000x GelRed 核酸染料的核酸瓊脂糖凝膠，加入1x TAE 緩沖液，將分析樣品與6x 上樣染色緩沖液混勻進行上樣。設定電壓150 V，運行30 min。電泳完成后，拍照分析。

1.3.5 Western blot 分析 將樣品進行SDS-PAGE 蛋白電泳，采用濕轉方式電轉到PVDF 膜。以350 mA電流模式，電轉90 min。電轉后的PVDF 膜，用PBST洗滌液進行清洗，再用快速封閉液（QuickBlockTM Western，上海碧云天生物技術有限公司）進行封閉15 min。將PVDF 膜置于一抗（兔抗衣殼蛋白多克隆抗體，體積比1∶1 000，美國Abcam 公司）中，于4 ℃下過夜孵育。用二抗（HRP標記的山羊抗兔抗體，體積比1∶2 500，艾美捷科技有限公司）室溫孵育2 h。使用超敏ECL（Enhanced Chemiluminescent）化學發光試劑盒配制顯色液（P0018S，碧云天生物技術有限公司），用Tanon 5020 儀器進行拍攝。采用ⅠmageJ 圖像分析系統對PCFP 融合蛋白的表達量進行檢測分析。

1.3.6 高分辨透射電子顯微鏡觀測 取20 μL PEⅠ/DNA 復合物樣品加在碳包裹銅網上。室溫放置15～30 min，用濾紙吸附掉多余樣品，用3%（30 g/L）磷鎢酸（Phosphotungstic Acid， PTA）進行負染色，靜置10 min，上樣，觀測樣品形態與大小。對病毒樣顆粒樣品先稀釋10 倍，取20 μL 測試目標蛋白樣品加在碳包裹銅網上。采用相同的操作方式，觀測樣品形態與大小。

1.3.7 小鼠免疫及小鼠抗衣殼蛋白血清抗體檢測

將4～6 周齡雌性BALB/c 小鼠在特定無病原體動物（SPF）級動物實驗室飼養，保持在溫度和光照受控的環境以及可隨意獲取食物和水條件，并在正式實驗前飼養7 d。小鼠按隨機分組，每組5 只小鼠。免疫方式采用腹腔注射。將PCFP 蛋白透析用緩沖液（1×PBS，pH 7.4）稀釋，再按體積比1∶1 與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑進行混合乳化，制備成質量濃度為100 μg/mL 的實驗疫苗，用于首免或加強免疫。在首免12 d 后進行一次加強免疫，注射體積為200 μL。小鼠眼眶取血，在第1 d、第14 d、第30 d 及第45 d 進行采集。轉速1 000 r/min，10 min 離心。使用小鼠（Mouse）圓環病毒2 型抗體（PCV-2-Ab）試劑盒對樣本進行抗體濃度測定。試劑盒采用衣殼蛋白作為抗原包被，根據試劑盒說明書進行操作，測定樣品數值。小鼠免疫評測如表2 所示。

表2 小鼠免疫評測Table 2 Ⅰmmunogenicity evaluation in mice

1.3.8 數據統計 數據以means ± SD 表示平均值±標準誤差。采用圖形和數據統計分析軟件（美國GraphPad Software 有限責任公司，GraphPadPrism 8 版本）進行分析，并使用未配對的t 檢驗（Student’s test）確定顯著性。 *p＜0.05 被認為具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 重組質粒構建

采用PENC 引物（表1） 進行PCR 擴增，獲得豬圓環病毒2 型 NDSU41513 毒株編碼的衣殼蛋白基因（GenBank no.KR816332.1）片段。如圖1（a）所示，在750 bp 處有PCR 擴增條帶，條帶大小與預期相符。將目標片段與pEGFP-N1 質粒雙酶切后進行連接，構建pEGFP-N1-Capsid 重組質粒。DNA 測序顯示重組質粒序列與目的序列完全一致，pEGFP-N1-Capid 重組質粒構建成功。設計了新的PCV2 衣殼融合蛋白PCFP，即將PCV2 衣殼蛋白的N 端1-41 位氨基酸切除，同時在C 端連接上豬ⅠgG Fc 片段。化學合成目的基因片段， 隨后利用PDCF 引物（表1）進行PCR 擴增。如圖1（b）所示，1 394 bp 處顯示的條帶大小與預期相符。將擴增的目的片段與pcDNA3.1（+）質粒雙酶切后進行連接，構建pcDNA3.1（+）-Capsid（△1-41aa）-Fc（pig）重組質粒，并通過核酸序列測序確認質粒構建成功。

圖1 PCR 擴增產物Fig.1 PCR products

2.2 PCV2 Capsid 基因在兩種不同宿主細胞轉染的差異

CHO-K1 和HEK293F 細胞廣泛應用在外源蛋白瞬時表達。然而，對于不同性質的蛋白，不同細胞往往表現出不同的表達偏向性[25]。本文分別考察了空載體和帶有PCV2 Capsid 基因的pEGFP-N1 質粒（pEGFP-N1-Capsid）在CHO-K1 和HEK293F 不同細胞轉染效率的差異。結果顯示（表3），在CHO-K1細胞中，轉染空載質粒pEGFP-N1 的轉染效率為24.12%，GFP 平均熒光強度值（RFU）為4 924.01，而轉染pEGFP-N1-Capsid 質粒時，轉染效率非常低，GFP的RFU 僅為82.90。而在HEK293F 細胞中，轉染pEGFP-N1 質粒的轉染效率達到35.48%，GFP 的RFU為13 506.92，pEGFP-N1-Capsid 質粒的轉染效率僅為7.06%，GFP 的RFU 為434.63。實驗結果表明，帶有PCV2 Capsid 基因能夠降低兩種宿主細胞轉染效率。然而，相對于CHO-K1 細胞，HEK293F 細胞在瞬時表達PCV2 Capsid 中表現出更好偏向性。

表3 pEGFP-N1 和pEGFP-N1-Capsid 質粒在HEK293 細胞和CHO-K1 細胞中轉染效率Table 3 Transfection efficiency of pEGFP-N1 and pEGFP-N1-Capsid plasmids transfected into HEK293 cells and CHO-K1 cells

2.3 不同PEI 轉染試劑在細胞轉染效率上的差異

為了提高轉染效率，實驗采用HEK293F 細胞作為瞬時轉染宿主細胞，w(PEⅠ)∶w(DNA)為1∶4，在分批培養和流加-分批培養兩種模式下分別考察了不同PEⅠ轉染試劑（PEⅠ-25 kDa 和PEⅠ-40 kDa）對轉染效率的影響。結果顯示（圖2（a）），采取流加培養模式，采用PEⅠ-40 kDa 轉染試劑，獲得實驗最高轉染效率35%。另外，PEⅠ-40kDa 實驗組的最大活細胞密度可達到6.2×106cells/mL，細胞活率為86%。而PEⅠ-25 kDa 實驗組的最大活細胞密度為3.9×106cells/mL，細胞活率為78%（圖2（b），2（c））。因此，在兩種不同的培養模式下， PEⅠ-40kDa 轉染試劑在HEK293F 細胞上表現出更好的轉染性能，可能是PEⅠ-40kDa 的低細胞毒性，獲得更高的細胞密度和轉染效率。

圖2 PEⅠ-25kDa 和PEⅠ-40kDa 轉染試劑的細胞轉染效率比較Fig.2 Transfection efficiency of PEⅠ-25kDa and PEⅠ-40kDa transfected into HEK293F

實驗也考察不同孵育時間對PEⅠ／DNA 復合物形成表觀電荷定性研究。以300 ng 質粒pEGFP-NⅠ-Capsid DNA 量，轉染試劑為 PEⅠ-40kDa，按PEⅠ/DNA不同質量分數比(0， 1∶4、1∶2、 1∶1、2∶1、4∶1、8∶1)配制，各樣品體積都為40 μL 的混合液。混合液在室溫下分別靜置孵育3 min 和30 min 后，在1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳阻滯實驗。結果顯示， 靜置孵育時間3 min的PEⅠ/DNA 混合樣品都向正極方向遷移（圖3（a）），表觀電荷表現為帶負電。而靜置孵育時間30 min 的PEⅠ/DNA 混合樣品，不同PEⅠ/DNA復合物樣品沒有出現向正極方向遷移的條帶，表觀電荷表現為正電（圖3（b））。另外，細胞轉染效率實驗顯示，對孵育時間3 min 的混合物進行細胞轉染，轉染效率非常低（數據未顯示）。這種差異有可能是帶負電質粒DNA不能被PEⅠ有效包裹，存在游離或吸附在PEⅠ外表面形式，影響DNA 進入細胞體內。

圖3 電泳阻滯實驗（EMSA）分析PEⅠ/DNA 不同質量分數比下相互結合能力Fig.3 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the binding ability of different PEⅠ/DNA mass fractions

2.4 透射電子顯微鏡觀測PEI/DNA 復合物

首先實驗考察對PEⅠ/DNA 不同質量分數比轉染HEK293F 細胞轉染效率的差異。實驗結果顯示，在質粒質量濃度為1 mg/mL 條件下，細胞轉染效率隨著PEⅠ與DNA 質量分數比提高而增強。 在w(PEⅠ)∶w(DNA)為8∶1 時，細胞轉染效率達到最高，為18.4%（圖4）。為了探究不同w(PEⅠ)∶w(DNA)對細胞轉染效率影響的原因，采用透射電子顯微鏡來觀測不同比例的PEⅠ/DNA 復合物在外觀形狀和尺寸大小的差異。結果顯示（圖5），在w(PEⅠ)∶w(DNA)為1∶1 時，復合物呈現為大于300 nm、松散且無規則形態。而在w(PEⅠ)∶w(DNA)為6∶1 時，復合物呈現為15～80 nm 大小顆粒形態。因此，PEⅠ/DNA 復合物比例影響形成復合物的大小與形態。由于細胞的胞吞作用是細胞攝入外源物質的重要方式，15～80 nm 大小的PEⅠ/DNA 復合物會有利于細胞的攝入，提高轉染效率。

圖4 PEⅠ/DNA 不同質量分數比轉染HEK293 細胞的轉染效率Fig.4 Transfection efficiency of different mass fractions of PEⅠ/DNA transfected into HEK293 cells

圖5 負染色透射電子顯微鏡觀測 PEⅠ/DNA 復合物的大小和形態Fig.5 Size and morphology of the PEⅠ/DNA complexes determined by negative staining transmission electron microscopy

2.5 PCFP 蛋白在3 L 反應器瞬時表達及其分子自組裝

在3 L 反應器中考察新型PCV2 衣殼融合蛋白PCFP 在HEK293F 細胞中瞬時表達情況。在HEK293F活細胞密度為2.0×106cells/mL，pcDNA3.1(+)-PCV2 Capsid(△1-41aa) –Fc(pig)質粒質量濃度為2 mg/L，PEⅠ-40kDa 與質粒以質量分數6∶1 比例混合，孵育30 min 瞬時轉染。結果顯示，細胞具有較好的生長狀態，最大活細胞密度達到5.0×106cells/mL（圖6（a））。葡萄糖質量濃度維持在2～5 g/L，細胞代謝副產物乳酸低于2.7 g/L 水平（圖6（b））。對培養6 d細胞上清以及超聲處理的細胞沉淀進行親和純化（圖6（c））。Western blot 分析顯示，獲得了一清晰目標條帶（圖6（d）），表達量約為3.8 mg/L。實驗成功實現了在3 L 反應器上瞬時轉染HEK293F 細胞表達新型PCV2 衣殼融合蛋白PCFP。對純化的PCFP蛋白進行負染色透射電鏡觀測，結果顯示，PCFP 在透射電鏡觀測下呈現大小約為41 nm 蛋白納米顆粒，形態類似于PCV2 滅活病毒（圖7）。PCFP 自組裝納米病毒樣顆粒特性，將為獲得更好免疫原性的疫苗研制提供結構基礎。

圖6 3 L 生物反應器中的PCFP 表達與純化Fig.6 Expression and purification of PCFP in a 3 L bioreactor

圖7 負染色透射電子顯微鏡觀測 PCFP 蛋白大小與形態Fig.7 Size and morphology of the PCFP protein determined by negative staining and transmission electron microscopy

PCV2 新型融合蛋白PCFP，能夠在3 L 反應器中獲得表達。主要原因如下：（1）對PCV2 衣殼蛋白富含堿性氨基酸的去除，降低了蛋白等電點，從11.02 改變為9.84。（2）通過在C 末端融合豬ⅠgG Fc 片段，進一步將等電點降低到8.78。（3）HEK293F細胞更適合表達病毒蛋白，最終在3 L 反應器中獲得3.8 mg/L 瞬時表達水平。此外，實驗通過負染色透射電鏡對PCFP 蛋白樣品觀測發現，PCFP 蛋白能夠自發形成形態類似于PCV2 病毒，大小約為41 nm顆粒。已有研究報道，當PCV2 Capsid 去除N 端核定位序列會影響病毒結構穩定性[26]。而本研究設計的PCFP 蛋白能自主裝形成約為41 nm 顆粒，推測可能是由于PCFP 蛋白Ⅰg Fc 形成鏈間二硫鍵，形成類病毒納米顆粒的主要原因。另外，研究表明，抗原提呈細胞（Antigen-Presenting Cells，APC）處理抗原時，抗原構象的穩定性會影響免疫原性和免疫極化。而在APC 細胞專職表達的Fc-γ 受體 (FcγR) 可以被高度特異性捕獲和呈遞，從而增強細胞免疫反應[27]。因此，可以推測PCFP 蛋白中的Fc 片段靶向APC 能增強機體免疫反應，獲得更好的免疫效果。

2.6 PCFP 蛋白免疫原性考察

對PCFP 蛋白及商業PCV2 疫苗 (CSV)免疫小鼠的血清進行 ELⅠSA 測定，以評估PCV2 Capsid 特異性抗體的產生情況。實驗采用沒有ⅠgG Fc 標簽的重組PCV2 Capsid 蛋白作為包被抗原，消除來自Fc 片段的干擾。結果顯示（圖8），PCFP 和 CSV 免疫的小鼠都產生抗 PCV2 Capsid 特異性抗體。在第1 次免疫 (days post injection，dpi) 及在第12 dpi 加強免疫后，抗 PCV2 Capsid 特異性抗體迅速增加，在 30 dpi后獲得較高的抗體濃度。同時也發現PCFP 蛋白免疫小鼠組比CSV 免疫的小鼠組產生更高濃度抗PCV2 Capsid 特異性抗體（p＜0.05）。顯然，PCFP 蛋白能夠有效誘導機體免疫系統產生抗PCV2 衣殼蛋白的特異性抗體。

圖8 抗PCV2 衣殼蛋白特異性抗體水平Fig.8 Specific antibodies levels of anti-PCV2 capsid

3 結 論

對PCV2 衣殼蛋白瞬時轉染條件進行考察，采用HEK293F 轉染宿主細胞，PEⅠ-40kDa 轉染試劑，w(PEⅠ)∶w(DNA)為1∶4，孵育30 min 進行轉染并進行流加培養，細胞轉染效率可達到35%。采用電泳阻滯實驗及負染色透射電子顯微鏡方法分析發現，復合物的表觀電荷及大小是影響轉染效率的重要原因。同時，我們成功在3 L 反應器中以HEK293F為宿主細胞進行新型PCV2 衣殼融合蛋白PCFP 瞬時表達，獲得3.8 mg/L 表達水平，并發現PCFP 蛋白具有自組裝大小41 nm 類病毒納米顆粒特性，同時能有效誘導機體免疫系統產生抗PCV2 衣殼蛋白的特異性抗體。并且PCFP 產生抗PCV2 衣殼蛋白抗體的濃度高于商業亞單位疫苗（CSV）。

與商業化桿狀病毒/昆蟲系統生產PCV2 衣殼蛋白相比， 本文所采用HEK293F 細胞瞬時轉染的表達量仍存在差距，但采用建立和篩選穩轉高產細胞株，以及在培養基和工藝方面進一步優化仍具有很大的經濟實用性潛力。