透明細胞腎細胞癌信號轉導及轉錄活化因子3 表達及其與臨床病理特征、免疫浸潤的關系

馮 歡 何昊瑋

東部戰區總醫院泌尿外科，江蘇南京 210000

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常見的一類腎臟異質性惡性腫瘤，透明細胞RCC（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）為RCC 的主要亞型，占70%～80%[1-2]。全身治療是晚期ccRCC 患者的主要治療方法[3]。然而，由于ccRCC 對傳統化療和放療具有耐藥性，需要進一步研究驅動ccRCC 起始和進展的分子機制，實現對這種異質性腫瘤的個體化醫療[4]。信號轉導及轉錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在多種癌癥的生長中起著重要作用，是JAK-STAT 信號通路的核心成分，其表達激活與病理進展和總體生存率差有關[5-6]。靶向STAT3 被認為是治療腫瘤的合適措施[7]。早期的研究表明，抑制STAT3 信號傳導可以有效降低ccRCC 細胞在體內和體外的增殖活性[8-9]。然而，STAT3 抑制是否能直接誘導癌癥細胞的免疫原性死亡及其潛在的分子機制尚不清楚。本研究利用組織微陣列（tissue microarray，TMA）對ccRCC 中STAT3 的表達及其與臨床病理參數的關系進行分析，并進一步通過數據庫信息探討STAT3 與免疫浸潤的相關性，為STAT3 靶點藥物的研發提供一定的醫學證據支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年3 月至2022 年1 月東部戰區總醫院泌尿外科手術切除的105 例ccRCC 患者的癌組織及43 例癌旁組織（距離腫瘤組織≥3 cm），其中男77例，女28 例；年齡30～87 歲，中位年齡60 歲。創建TMA 并進行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色分析，回顧性分析患者臨床和病理信息（包括年齡、性別、腫瘤大小、Fuhrman 分級、T 分期、淋巴結轉移）。納入標準：①符合2022 版歐洲泌尿外科學會腎癌診療指南中的ccRCC 診斷標準[10]；②接受根治性或部分腎切除術治療，術后癌組織經病理檢查證實為ccRCC 組織；③臨床病歷資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②肝、腎功能嚴重異常；③術前接受放化療等腫瘤治療；④患有嚴重感染。該研究獲得了東部戰區總醫院倫理委員會的批準（YL2022-0103）。

1.2 TMA 及IHC 分析

由105 個ccRCC 和43 個癌旁正常腎臟石蠟包埋樣本構建TMA，先用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）對每個樣本的一個切片（4 μm）進行染色，并對代表性區域的選擇進行審查。對每個樣品使用半自動組織芯片（加拿大CHEMICO International）獲得3 個直徑為1 mm 的代表性區域，將組織以間隔排列模式進行石蠟包埋，使用EnVisionTM+Dual Link System-HRP（DAB+）試劑盒（美國Dako，貨號#K4065）用于IHC 分析。所用一級抗體STAT3（美國abcam，ab194307）以1∶100比例稀釋對載玻片進行染色，并使用二氨基聯苯胺（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZLI-9017）進行顯色。染色由2 名對疾病結果不知情的腎臟病理學專家獨立進行評估。根據STAT3 的染色強度（0～3分）和頻率（0～4 分）進行評分，按STAT3 的表達水平將其分為STAT3 高表達（≥2 分）和STAT3 低表達患者（＜2 分）[11]。

1.3 TIMER 數據庫分析

TIMER 數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer）用于探索STAT3 基因表達與ccRCC 的免疫細胞浸潤之間的關聯，以評估TCGA 中腫瘤浸潤免疫細胞（tumor infiltrating immune cell，TIIC）的豐度。選擇基因模塊來分析ccRCC 隊列（n=533）中STAT3 與6 個TIIC亞群（即B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）之間的關系，選擇純度調整后的樣品。

1.4 TISIDB 數據庫分析

TISDB 數據庫（http://cis.hku.hk/TISIDB）含有包括TCGA 在內的多個公共數據庫，選擇淋巴細胞和免疫調節器模塊（n=534）來研究STAT3 基因表達與ccRCC 中腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）和免疫抑制劑豐度之間的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料采用例數和百分率表示，比較采用χ2檢驗。采用偏相關系數（partial correlation coefficient,PCC）和Spearman 相關系數分析相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ccRCC 癌組織及癌旁組織STAT3 的TMA-IHC結果

TMA-IHC 分析顯示，STAT3 陽性信號分布于大多數鄰近的非腫瘤腎小管上皮細胞和惡性腫瘤細胞漿中，105 例ccRCC 癌組織中，共有53 例（50.48%）STAT3蛋白呈陽性表達，陽性表達率高于癌旁腎臟組織（32.56%，14/43），差異有統計學意義（χ2=3.953，P=0.046）。HE 染色顯示，免疫細胞零星分散在ccRCC 組織中，提示ccRCC 組織中豐富的免疫浸潤。見圖1。

圖1 ccRCC 癌組織及癌旁組織STAT3 的TMA-IHC 結果

2.2 ccRCC 組織STAT3 表達與臨床病理特征的關系

STAT3 表達與ccRCC 患者腫瘤大小、Fuhrman 分級、T 分期、淋巴結轉移情況有關（P＜0.05）。見表1。

表1 ccRCC 組織STAT3 表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 TIMER、TISIB 數據庫分析

TIMER 數據庫分析顯示，STAT3 表達與B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈正相關（PCC＞0，P＜0.05）。TISIDB 數據庫分析顯示，STAT3 表達自然殺傷細胞、調節性T 細胞豐度呈正相關（rs＞0，P＜0.05），并且與CD56bright、CD56dim自然殺傷細胞豐度呈負相關（rs＜0，P＜0.05）。見圖2～3。

圖2 ccRCC 患者STAT3 表達與腫瘤浸潤免疫細胞的相關性

圖3 ccRCC 患者STAT3 表達與腫瘤浸潤淋巴細胞的相關性

3 討論

作為一種眾所周知的異質性疾病，RCC 仍然缺乏有助于個體化治療選擇和預后預測的生物標志物[1-2]。因此，臨床迫切需要研究與ccRCC 發生、發展相關的分子標志物，以更好地了解該疾病的發病機制，從而實現個體化醫療和改善臨床結局。STAT3 是STAT 家族的重要成員，目前被認為是一種致癌基因，其異常調控已在近70%的癌癥中被報道[12-13]。STAT3 通過參與細胞的侵襲、遷移、轉移和血管生成，促進細胞繁殖和惡性轉化，通過多種途徑阻礙細胞凋亡，從而參與腫瘤的發生、發展。癌細胞中STAT3 的異常激活導致細胞生長因子和抗凋亡分子的持續轉錄，這些因子和抗凋亡分子在維持細胞生長和存活中起著至關重要的作用[14-16]。例如STAT3 已被發現在結腸癌和胃癌中持續激活，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常表達[17-23]。此外，已有研究證實STAT3 可促進ccRCC細胞的增殖、侵襲和轉移，在ccRCC 中發揮原癌性作用[24]。本研究采用TMA-IHC 法檢測STAT3 在ccRCC癌組織及癌旁正常組織中表達，結果顯示STAT3 在癌組織中高表達患者占比高于癌旁組織中高表達患者，與既往研究結果一致，提示STAT3 參與了ccRCC發生過程[24]。

STAT3 在惡性腫瘤中高表達，與腫瘤分化程度或淋巴結轉移有關[25]。既往研究發現，STAT3 在子宮內膜癌中的陽性表達與子宮肌層浸潤深度及腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移顯著相關[22]。為進一步研究STAT3 表達與ccRCC 臨床病理特征的相關性，本研究比較不同STAT3 表達水平ccRCC 患者臨床病理特征差異，結果顯示，STAT3 表達水平與ccRCC 患者的腫瘤大小、Fuhrman 分級、T 分期、淋巴結轉移具有相關性，提示STAT3 促進了ccRCC 侵襲、轉移過程。這可能歸因于STAT3 信號轉導和轉錄調控的雙重功能，STAT3 通過促進腫瘤細胞生長增殖、侵襲轉移及免疫逃逸，參與腫瘤的發生、發展，但其在ccRCC 中的具體機制有待進一步研究予以證實[26-27]。

此外，本研究結果還顯示，STAT3 與腫瘤免疫浸潤有關。腫瘤微環境中的免疫浸潤不僅與癌癥患者的預后有關，而且具有很大的癌癥治療潛力。研究表明，一些免疫浸潤細胞，包括調節性T 細胞、巨噬細胞、CD8+T 細胞和樹突狀細胞，對RCC 進展有很大影響[28-29]。在本研究中，HE 染色結果顯示，免疫細胞零星分散在ccRCC 組織中，提示ccRCC 組織中豐富的免疫浸潤。此外，本研究使用TIMER、TISIDB 數據庫進一步評估了STAT3 與ccRCC 中免疫特征之間的關系。TIMER分析顯示，STAT3 表達與所有6 種TIIC 亞群的浸潤水平呈正相關，包括B 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。TISIDB 分析結果顯示，STAT3 表達與大量TIL 的豐度顯著相關，包括自然殺傷細胞、調節性T 細胞，并且與CD56bright和CD56dim自然殺傷細胞的豐度呈負相關。以上結果顯示，STAT3 表達升高會影響免疫細胞浸潤，提示STAT3 對調節ccRCC 中的腫瘤免疫浸潤具有重要意義，可能作為免疫治療的潛在靶點。

綜上，STAT3 高表達與ccRCC 臨床病理特征較差有關；此外，STAT3 與腫瘤免疫浸潤顯著相關，對于控制免疫細胞浸潤很重要，可能是一種有價值的預后生物標志物。但本研究仍具有一定局限性，例如樣本量較小，需要更多的臨床樣本分析研究來驗證上述發現。此外，為了對STAT3 如何影響ccRCC 免疫浸潤的精確過程提供更多信息，需要進行進一步的體內或體外實驗。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。