自噬對鋅指轉錄因子1及高糖誘導的腎小管EMT的影響*

安小敏, 李清璇, 王彤, 龍天華, 楊鵬, 盧雨微, 張小龍, 郭兵,4, 石明雋,5***

(1.貴州醫科大學 病理生理學教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 3.地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 4.貴州省常見重大慢性疾病發病機制及藥物開發應用創新基地, 貴州 貴陽 550025; 5.貴州醫科大學省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

隨著糖尿病發病率逐年升高,其并發癥糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)的發病率也逐漸增加,成為終末期腎功能衰竭的重要原因[1]。腎小管上皮細胞-間充質轉化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)能增加腎間質細胞外基質(extracellular matrix, ECM)沉積、促進腎間質纖維化及DKD的發生發展[2],但DKD時EMT的發生機制尚不十分明確。鋅指轉錄因子1(zinc-finger transcription factor 1, Snail1)是上皮細胞向間充質細胞轉化和癌癥相關成纖維細胞活化所必需的轉錄因子。Snail1可抑制E-鈣粘附素基因表達,誘導EMT[3]。本課題組的前期研究發現,在高糖培養的原代大鼠腎小管上皮細胞中Snail1的表達明顯增多,并且在高糖培養的腎小管上皮細胞中敲低內源性Snail1能明顯降低其分泌ECM的能力[4],提示Snail1可能影響腎小管上皮細胞EMT而促進DKD時腎纖維化的發生。但在DKD中,腎小管上皮細胞內Snail1蛋白增多的機制尚不清楚。自噬是細胞內蛋白降解的兩種主要途徑之一,通過自噬小體與溶酶體的融合可降解自噬小體內包裹的老化細胞器、侵入的病原體及蛋白質等,從而實現細胞穩態、能量的生成和細胞器的更新等作用。本課題組前期研究與國內外大量研究發現糖尿病(DM)大鼠模型中,腎組織的自噬水平明顯受到抑制[5-6],而提高其自噬水平能明顯抑制DKD的發生發展[7],表明自噬與DKD的發生發展密切相關。Grassi等[8]發現在肝細胞中抑制自噬能明顯減少Snail1蛋白的自噬性降解,促進EMT的發生。但在DKD中,自噬是否通過調控Snail1的降解而影響腎小管上皮細胞EMT過程,目前尚不清楚。因此本研究擬以DM大鼠和高糖培養的大鼠NRK-52E細胞為研究對象,研究自噬對Snail1以及大鼠腎小管上皮細胞EMT的調控作用及機制,為進一步深入理解DKD腎纖維化發病機制、尋找治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12只,體質量180～220 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產許可證號SCXK(京)2009-0007],動物實驗規程已獲貴州醫科大學動物倫理委員會批準,符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。NRK-52E細胞購自(上海中科院細胞庫),鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ;美國Sigma公司),逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑(北京中杉公司),胎牛血清(FBS,以色列BIOIND公司),抗微管蛋白(β-Tublin)抗體、抗體辣根過氧化物酶標記羊抗兔和羊抗小鼠IgG(武漢普美克生物技術有限公司),兔抗微管相關蛋白1輕鏈 3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3-Ⅱ/Ⅰ;北京博奧森生物技術有限公司),兔抗Snail1、鼠抗自噬降解底物蛋白1(sequestosome 1, SQSTM1/p62;美國Abcam公司)、兔抗自噬基因BECN 1(coiled-coil myosin-like BCL2-interacting protein, Beclin1;美國Abcam公司),二甲基亞砜(DMSO;北京索萊寶科技有限公司),雷帕霉素(RAP,蘇州碧云天有限公司),氯喹(CQ)、放線菌酮(CHX)及蛋白酶抑制劑(MG-132,美國ECM公司),雙標熒光腺相關病毒(Lenti-mCherry-EGFP-LC3B,碧云天生物技術)。所用引物由上海生物工程股份有限公司根據設計合成。

1.2 研究方法

1.2.1動物模型建立、分組和動物標本采集 大鼠適應性喂養1周,隨機抽查大鼠血糖均<8 mmol/L,隨機分為正常對照(NC)組和DM組,每組6只。模型復制方法參照文獻[8],禁食不禁水6 h后,乙醚麻醉大鼠,DM組予尾靜脈注射2%的STZ(53 mg/kg,用高壓后的0.1 mol/L、pH 4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置,即配即用),NC組注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后測大鼠血糖,以空腹血糖≥16.7 mmol/L判斷為DM模型復制成功,2周后行醋酸法進行尿蛋白定性測試,尿蛋白陽性者判斷腎功能損害,發生DKD。造模成功后第24周末處死兩組大鼠,處死前1 d收集24 h尿液,記錄24 h尿量。處死前禁食不禁水6 h,股動脈取血,室溫離心(1 000 r/min,5 min)后取上清,-20 ℃保存。處死大鼠后取腎組織,冠狀切面約2 mm厚片,部分于4%甲醛溶液中固定,其余部分凍在-80 ℃保存備用。

1.2.2生化指標檢測 收集的血清送至貴陽金域檢驗中心進行生化指標檢測(雅培2000全自動生化檢測儀)檢測血糖、血尿素氮(BUN)和尿白蛋白(UAlb)計算24 hUAlb(24 h尿量和尿白蛋白的乘積)。

1.2.3細胞培養及分組 NRK-52E細胞置于二氧化碳(CO2)孵箱中培養(DMEM培養基,10%FBS,5%CO2,37 ℃),待細胞密度達到50%時,加入無血清的DMEM培養液同步化培養細胞12 h后,將細胞分為正常糖組(NG,5.5 mmol/L)、高糖組(HG,30 mmol/L)、高滲組(HM,30 mmol/L)和高糖+藥物組(HG+自噬激動劑RAP或抑制劑CQ),含1%FBS相應培養基繼續培養48 h后收集細胞蛋白和/或RNA標本進行相關檢測。

1.2.4免疫熒光化學染色觀察P62、Snail1、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達 將NRK-52E細胞在12孔板中進行爬片,根據分組分別用相應培養基培養48 h后,棄培養基,PBS洗滌,4%多聚甲醛室溫固定15 min,預冷的PBS洗滌(5 min×3次),加入0.2%TritonX-100室溫放置6 min,PBS洗滌(5 min×3次),3%BSA室溫孵育封閉30 min,滴加一抗,4 ℃冰箱孵育過夜;次日室溫復溫30 min,PBS洗滌(5 min×3次),加入熒光二抗37 ℃避光孵育1 h,PBS洗滌(5 min×3次),抗熒光猝滅劑封片后,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍攝保存圖像。

1.2.5Western blot法檢測自噬、EMT、纖維化相關指標 -80 ℃冰箱凍存的大鼠腎組織,每只鼠取100 mg腎皮質加蛋白裂解液1 mL,高通量研磨機研磨;細胞樣本則根據細胞量多少加入適量蛋白裂解液,用細胞刮刮取細胞。組織或細胞樣本置于4 ℃裂解30 min后離心(4 ℃,12 000 r/min,15 min),取上清液變性制備蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉,分別加入抗體[小鼠抗β-Tublin抗體(1∶1 000)、兔抗α-SMA(1∶1 000)、兔抗collagen Ⅲ(1∶1 000)、鼠抗E-cadherin抗體(1∶1 000)、兔抗Snail1(1∶1 000)、兔抗p62(1∶1 000)、兔抗LC3(1∶1 000)、兔抗Beclin1(1∶1 000)],4 ℃冰箱孵育過夜;TBST洗膜,加入相應的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠Ⅱ抗(1∶10 000)、山羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000),室溫搖床孵育1 h;TBST洗滌,Smart-ECL發光試劑在凝膠成像儀進行化學發光曝光,以β-tubulin作為內參,實驗重復3次,用蛋白條帶結果用Image Lab5.0軟件進行分析各個條帶灰度值,計算相對表達量后統計數據。

1.2.6免疫共沉淀實驗驗證P62與Snail1之間相互作用 NRK-52E細胞密度達到50%時,加入無血清的DMEM培養液同步化培養細胞12 h后,將NG組和HG組細胞繼續培養48 h后棄培養液,PBS清洗3遍,加入細胞裂解液500 μL,冰上裂解30 min,把裂解好的細胞刮下來,冰上超聲：強度37%,4 s、3次,離心取上清(4 ℃,15 min,12 000 r/min),每500 μL裂解液加入ProteinA+G磁珠20 μL,室溫翻轉搖床上緩慢翻轉1 h。NG組又分為全蛋白組(Input組)和IP組(IP組又分為陰性對照IgG組和實驗組Snail1/P62)。磁分離取出磁珠后按IP實驗中所需抗體稀釋比例加對應的抗體,4 ℃翻轉搖床上緩慢翻轉過夜。用預冷的細胞裂解液500 μL洗3次磁珠,最后1次按照初始體積加入裂解液,每400 μL裂解液加入100 μL 1×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液,100 ℃金屬浴10 min,磁分離把磁珠離心至管底,取上清進行Western blot。

1.2.7Lenti-mCherry-EGFP-LC3B檢測自噬流 共聚焦皿中培養NRK-52E細胞,細胞密度達50%時,更換培養液(約加入正常培養體系的1/2體積),然后根據預實驗結果加入相應體積的病毒液培養6 h后,補充培養液至正常體系,繼續培養48 h,激光共聚焦顯微鏡觀察自噬流情況并拍攝保存圖像。所有操作均需避光。

1.2.8驗證上調或抑制自噬后對Snail1蛋白降解作用的影響 CHX作為蛋白合成抑制劑,加入后可阻斷蛋白合成的來源,MG-132作為泛素-蛋白酶體降解途徑的阻斷劑,可以阻斷蛋白通過泛素途徑的降解,聯合CHX與MG-132處理后,可將蛋白通過自噬降解的多少作為單一變量進行觀察。在正常糖中聯合CHX和MG-132處理NRK-52E細胞,收集0、1、2、4、6、8及10 h的蛋白;在HG條件下分別使用RAP上調自噬或CQ抑制自噬48 h,再聯合使用CHX+MG-132處理細胞,分組為HG+DMSO/RAP組、HG+DMSO/CQ組,收集0、6及10 h的蛋白,Western blot觀察Snail1的衰減速率。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠的一般情況及生化指標

造模后72 h,DM組大鼠血糖≥16.7 mmol/L,提示糖尿病模型復制成功。造模第2周后,每周監測大鼠血糖、體質量,NC組大鼠血糖正常,體質量穩定增加,DM組大鼠出現多飲、多食、多尿癥狀,體質量增長減慢甚至減輕。24周時處死大鼠,血和尿生化檢測結果顯示,與NC組相比,DM組大鼠血糖、BUN、24 h UAlb升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 NC和DM組大鼠血糖、BUN、24 h UAlb的變化Tab.1 The changes of rat blood glucose, BUN, and 24 h UAbl in NC and DM

2.2 DM大鼠腎組織和高糖培養的NRK-52E中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達減少,p62表達增加

Western blot結果顯示(圖1),在DM組大鼠腎組織和高糖培養的NRK-52E中,p62表達增加,LC3-Ⅱ/Ⅰ減小,Beclin1表達減少,差異有統計學意義(P<0.05)。提示高糖環境中腎小管上皮細胞自噬受到抑制。

注：A為大鼠腎組織結果,B為高糖刺激NRK-52E細胞結果;(1)與NC組比較,P<0.05。

2.3 高糖培養的NRK-52E細胞中自噬流受阻

如圖2結果所示,HG培養的NRK-52E中自噬流阻滯在自噬溶酶體融合(晚期)之前。

2.4 在高糖培養的NRK-52E中上調自噬可緩解EMT、減少ECM沉積,抑制自噬時結果相反

Western blot結果顯示,RAP刺激后,與HG組相比,HG+RAP組中p62表達降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ增加,Beclin1表達升高(P<0.05,圖3A);提示自噬水平提高;HG+RAP組中α-SMA、Collagen Ⅲ的表達減少,E-cadherin表達增多(P<0.05,圖3B);提示提高自噬水平后抑制了腎小管上皮細胞EMT,且ECM減少。CQ刺激后,與HG組相比,HG+CQ組中LC3-Ⅱ/Ⅰ增加,p62表達增多,Beclin1表達減少(P<0.05,圖3C);提示自噬溶酶體降解受到抑制;HG+CQ組中α-SMA、Collagen Ⅲ的表達增多,E-cadherin表達減少(P<0.05,圖3D);提示抑制自噬后加劇了EMT,且ECM沉積增多。

注：A為RAP刺激后LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1的表達變化,B為RAP刺激后α-SMA、E-cadherin以及Collagen Ⅲ的表達變化;C為CQ刺激后LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin1的表達變化;D為CQ刺激后α-SMA、E-cadherin、Collagen Ⅲ的表達變化;(1)與HG組比較,P<0.05。

2.5 免疫熒光觀察到在高糖培養的NRK-52E中上調自噬可緩解EMT,抑制自噬時結果相反

如圖4結果所示,細胞免疫熒光觀察到,與HG組相比,HG+RAP組中p62、α-SMA表達減少,E-cadherin表達增多,差異有統計學意義(P<0.05),而HG+CQ組中結果相反,差異有統計學意義(P<0.05)。提示上調自噬可以延緩EMT的發生,抑制自噬則可促進EMT的發生。

注：A、B、C分別為各組NRK-52E中p62、α-SMA和E-cadherin的表達;(1) 與HG組相比,P<0.05;(2) 與HG組相比,P<0.05。

2.6 DM大鼠腎組織及高糖培養的腎小管上皮細胞中Snail1的表達及自噬對Snail1的調控

在DM大鼠腎組織及高糖培養的NRK-52E中,與NC組相比,DM組Snail1蛋白增多(P<0.05);與NG組相比,HG組Snail1蛋白增多(P<0.05,圖5A);在NRK-52E細胞中,使用自噬激動劑RAP刺激后,與HG組相比,HG+RAP組Snail1的蛋白表達減少,而使用自噬抑制劑CQ刺激后,與HG組相比,HG+CQ組Snail1的蛋白表達增多(P<0.05,圖5B);免疫共沉淀結果顯示,Snail1與p62之間存在蛋白相互作用(圖5C);免疫熒光結果觀察到Snail1與p62存在共定位現象(圖5D)。以上結果提示在高糖環境中Snail1表達增多,且可能通過p62連接,進入到自噬途徑降解。

注：A為Western blot測定DM大鼠及高糖培養的NRK-52E中Snail1表達;(1) 與NC組相比,P<0.05;(2) 與NG組相比,P<0.05;B為Western blot測定RAP/CQ組中Snail1的蛋白水平;(1) 與HG組相比,P<0.05;(2) 與HG組相比,P<0.05;C為免疫共沉淀結果;D為細胞免疫熒光結果(400×)。

2.7 自噬對高糖培養的腎小管上皮細胞Snail1降解的作用

Western blot結果顯示：CHX、MG-132合并刺激NKR-52E不同時間,在NG組中觀察到Snail1蛋白半衰期約為6 h(在第6小時衰減到51%),而在第10小時則減少到11%(圖6A),故后續實驗采用0、6及10 h這3個時間點作為Snail 1蛋白衰減的觀察時間。在HG條件下分別使用RAP上調自噬或CQ抑制自噬48 h,再聯合使用CHX+MG-132處理細胞,結果顯示,與HG+DMSO組相比,在HG+RAP組中上調自噬后第6小時Snail 1蛋白衰減速率明顯較DMSO組加快(42%比89%),10 h時Snail1的衰減速率更快(16%比86%);與HG+DMSO組相比,HG+CQ組中抑制自噬后第6小時Snail 1蛋白衰減速率較DMSO組無明顯變化(97%比98%),而10 h時Snail 1蛋白衰減較DMSO組更慢(96%比89%)。提示Snail1通過自噬途徑降解,而調控自噬水平可以調控Snail1蛋白的降解速率。

注：A為Snail1蛋白衰減時間點的摸索,線圖中方框表示在CHX+MG-132聯合處理下,Snail1蛋白半衰期約為6 h(在第6小時衰減到51%);B為RAP刺激后Snail 1蛋白的衰減速率變化;C為CQ刺激后Snail1蛋白的衰減速率變化。

3 討論

目前我國DM患者人數居世界首位,在我國20～79歲成年人中,發病率高達10%[1],DKD是糖尿病最普遍且嚴重的并發癥之一,是DM患者終末期死亡的主要原因[2-3]。腎間質纖維化是引發DKD終末期腎功能衰竭的主要原因[4,9-10],腎間質纖維化時正常的腎小管和腎間質結構被大量聚集的ECM所代替,最終引起腎功能衰竭[5]。腎小管EMT能增加腎間質內ECM的沉積、促進腎間質纖維化及DKD的發生發展[11-15]。本研究結果證實在DM大鼠腎組織及高糖培養的NRK-52E細胞中α-SMA、Snail1表達均增高,E-cadherin表達降低,Collagen Ⅲ的表達增高,高糖環境下腎小管上皮細胞發生了EMT、ECM沉積增多;細胞免疫熒光實驗也證實了上述結果。

近年來有研究發現,自噬與EMT的發生發展密切相關[16-18]。除了泛素-蛋白酶體降解途徑外,自噬是細胞中蛋白質降解的另一種主要途徑。在自噬過程中,LC3-Ⅰ會先經自噬相關基因 7(autophagy-related gene 7, ATG7)和自噬相關基因3(autophagy-related gene 3, ATG3)等蛋白修飾和加工,再與磷脂酰乙醇胺(PE)相偶聯形成LC3-Ⅱ,并定位于自噬體內外膜上。因此,即可通過觀察LC3-Ⅱ/Ⅰ的變化可預測自噬水平的高低;除LC3之外,p62是目前研究較廣泛的另一個自噬底物。在自噬體形成過程中,p62可標記需被降解的蛋白并鏈接到LC3上,繼而將其包裹入自噬體,再進入溶酶體中降解,所以p62蛋白的表達量與自噬活性呈負相關[19]。Beclin1是調節自噬的主要分子之一[20],上調Beclin1的表達能提高細胞自噬水平、抑制EMT發生[21],而敲低Beclin1則能明顯抑制細胞自噬水平促進EMT的發生[22]。前期研究發現DKD大鼠模型及高糖培養的腎小管上皮細胞模型中Beclin1表達明顯降低,自噬受到抑制[7,23]。本研究結果顯示,在高糖環境中p62蛋白表達增多,LC3、Beclin1表達減少,進一步證實在高糖環境的腎小管上皮細胞中自噬受到抑制;使用LC3雙標腺病毒轉染結果顯示,在高糖培養的NRK-52E細胞中自噬流被阻滯。RAP刺激是較為常用的自噬活化方法,而CQ是一種常用的自噬抑制劑,可以通過提升溶酶體內pH值進而阻斷細胞自噬活性。有研究人員發現,在HK2細胞中使用CQ可拮抗由膽固醇誘導的EMT[24];而使用RAP提高自噬水平可明顯延緩EMT的發生[25-27]。本實驗使用CQ和RAP刺激高糖培養的NRK-52E,觀察調節自噬對EMT的影響,結果證實RAP上調自噬可以部分逆轉高糖下的EMT發生和ECM沉積增多,而在CQ組中呈現出了相反的結果。但自噬對EMT調控的機制尚未明確。

Zou等[28]發現在人心臟微血管內皮細胞中,缺氧能抑制p62與Snail1蛋白的相互作用,從而減少自噬-溶酶體途徑對Snail1蛋白的降解,促進心內皮細胞間充質轉化的發生;RAP刺激則能增強自噬-溶酶體途徑對Snail1蛋白的降解,抑制缺氧誘導的心內皮細胞間充質轉化。另有研究發現,提高乳腺癌細胞的自噬水平能明顯增強自噬-溶酶體途徑對Snail1蛋白的降解,從而減少EMT的發生[29]。Snail1屬于鋅指蛋白轉錄因子家族的成員,在EMT過程中發揮關鍵作用,可與E-cadherin啟動子的E-box序列結合,抑制E-cadherin的表達,從而啟動EMT進程。本研究免疫共沉淀結果顯示,Snail1與p62之間存在蛋白相互作用;免疫熒光結果發現,Snail1與自噬小體在細胞中存在共定位。提示Snail1可能通過p62被攜帶入自噬體中,再與自噬體融合進入溶酶體被降解。因此擬觀察在高糖培養的腎小管上皮細胞中,調控自噬水平對Snail1降解速率變化的影響。CHX作為蛋白合成抑制劑可以阻斷蛋白的生成,而CHX MG-132則可阻斷蛋白通過泛素-蛋白酶體的降解,因此使用CHX和MG-132刺激細胞后,可觀察Snail1蛋白通過自噬降解的情況。與對照組相比,上調自噬后Snail1蛋白降解加快,抑制自噬后Snail1蛋白降解減慢,提示Snail1可能通過與車載蛋白p62結合,進入到自噬小體當中,跟隨自噬小體進入到溶酶體被降解,并且受到自噬狀態的影響。

綜上,在DM大鼠腎組織及高糖培養的腎小管上皮細胞中自噬受到抑制,Snaill通過自噬途徑降解減少,從而促進了EMT發生,最終導致DN腎纖維化。以上結果對進一步明確EMT的發生機制,從而為尋找抑制其啟動、減少ECM的沉積及找尋DKD腎間質纖維化的防治靶點提供了實驗基礎。