M1巨噬細胞培養液對ER陽性乳腺癌細胞上皮-間質轉換的影響及Calpain的介導作用*

詹云惠, 金愛, 王旭東

(貴州醫科大學 基礎醫學院 生理學教研室, 貴州 貴陽 550025)

惡性腫瘤細胞遠處轉移是乳腺癌患者生存不良的主要原因[1]。以往對乳腺癌的發生、發展及轉移機制的研究主要局限于腫瘤細胞本身,然而近年來研究顯示,腫瘤微環境(tumor microenvironment, TAE)在腫瘤發生、發展進程中起到重要作用[2]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)可促進乳腺癌細胞遷移、侵襲,包括上皮細胞-間充質轉換(epithlial- mesenchymal transition, EMT),并與乳腺癌預后不良有關[3-4]。根據局部微環境和細胞因子不同,TAM可被極化為替代性活化(M2)和經典活化(M1)兩種表型。M2巨噬細胞可產生細胞因子、生長因子等,發揮促癌作用,而M1型巨噬細胞可高表達一氧化氮、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),并可促進免疫反應,發揮殺腫瘤作用[5]。一般認為M1巨噬細胞具有抗腫瘤特性,并被視為癌癥的潛在治療策略[6];但也有研究認為,M1巨噬細胞促炎性分泌因子可以誘導乳腺癌細胞EMT,從而促進乳腺癌細胞遷移、侵襲[7]。由此可見,關于M1樣巨噬細胞在乳腺癌發展過程中的作用目前尚有爭議,其信號機制也不明確,因此本研究通過細胞分子生物學手段探究M1巨噬細胞條件培養液對乳腺癌細胞EMT的影響及Calpain在其中的介導作用,力圖為探尋乳腺癌的臨床治療提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1材料 人乳腺癌細胞系雌激素受體陽性(estrogen receptor positive,ER+)細胞MCF-7、T47D,雌激素受體陰性(estrogen receptor negative,ER-)細胞MDA-MD-231,人單核白血病細胞株THP-1(中國科學院昆明細胞庫)。

1.1.2試劑 RPMI-1640培養基、DMEM培養基、青-鏈霉素(PS,Hyclone公司),THP-1細胞全培養基(上海偉進生物科技有限公司),胎牛血清(FBS,Biological Industries公司),Calpeptin、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、脂多糖(lippolysaccharide,LPS)試劑(Sigma公司),γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)試劑(PeproTech公司),抗纖連蛋白(fibronectin,FN)多克隆抗體(Abcam公司),抗細胞上皮-鈣黏素(E-cadherin,E-cad)多克隆抗體、抗波形蛋白(vimentin,Vim)多克隆抗體、蛋白內參抗體(raldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH;Cell Signaling Technology公司),羊抗小鼠IgG-HRP抗體及羊抗兔IgG-HRP抗體(Bioworld公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒(bicinchoninic acid,BCA)、全細胞裂解液(radio-immunoprecipitation assy,RIPA)及蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl,PMSF;碧云天生物技術有限公司),Calpain inhibitor Ⅲ(Merck公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 THP-1細胞用THP-1細胞全培養基,MCF-7細胞、T47D細胞及MDA-MD-231細胞用DMEM (含10%FBS和1%PS)培養基,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗分為RPMI-1640組(對照)、M1巨噬細胞條件培養液(M1-CM)組、M1-CM聯合Calpain抑制劑Calpeptin(50 μmoL/L)組及M1-CM聯合Calpain抑制劑Calpain inhibitor Ⅲ(50 μmoL/L)組;以RPMI-1640純培養基分別培養MCF-7細胞、T47D細胞、MDA-MB-231細胞得到相應細胞的RPMI-1640組;以M1-CM分別培養MCF-7細胞、T47D細胞、MDA-MB-231細胞得到相應細胞的M1-CM組;以Calpain抑制劑Calpeptin(50 μmoL/L)分別預處理MCF-7細胞、T47D細胞后,再以M1-CM培養MCF-7細胞、T47D細胞,得到相應細胞的M1-CM+Calp組;以Calpain抑制劑Calpain inhibitor Ⅲ(50 μmoL/L)分別預處理MCF-7細胞、T47D細胞后,再以M1-CM培養MCF-7細胞、T47D細胞,得到相應細胞的M1-CM+CI-Ⅲ組。

1.2.2M1巨噬細胞轉化及驗證 將2×106個THP-1細胞置于6孔板中(THP-1組),以 100 μg/L PMA處理48 h轉化為M0巨噬細胞(M0組),再以LPS (100 μg/L)、IFN-γ (20 μg/L)處理M0巨噬細胞48 h轉化為M1巨噬細胞,以RPMI-1640純培養基培養M1巨噬細胞 48 h,所得上清即為M1-CM(M1-CM組)。以qRT-PCR及Western blot分別檢測轉化的M0及M1巨噬細胞中趨化因子配體10(CXC chemokine ligand-10,CXCL10)、趨化因子受體7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)、白細胞介素12(interleukin-12,IL-12) mRNA及蛋白表達水平[8]。若與M0巨噬細胞相比,M1巨噬細胞中 CXCL10、CCR7及IL-12 mRNA與蛋白表達水平上調,即M1樣巨噬細胞轉化成功。

1.2.3劃痕愈合實驗觀察MCF-7細胞、T47D細胞、MDA-MB-231細胞遷移能力 將細胞鋪于12孔板,培養至90%～100%滿度后,用200 μL槍頭在培養皿底作十字劃痕,形成無細胞區(寬約1.5 mm),按實驗要求對各組細胞進行處理。分別在0及24 h拍照記錄細胞遷移情況,24 h細胞遷移距離=0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度;擬定對照組(依次為RPMI-1640組、M1-CM組、M1-CM組)遷移率為100 %,實驗組(M1-CM組,M1-CM+Capl組,M1-CM+CI-Ⅲ組)24 h細胞遷移率=24 h實驗組細胞遷移距離/24 h對照組細胞遷移距離×100 %。

1.2.4Transwell法觀察MCF-7細胞侵襲能力 8 μm小室上室加入60 μL無血清培基稀釋的基質膠至凝固后, 取指數生長期MCF-7細胞,向上室加入5×105個細胞的300 μL無血清培養, 下室加入20% FBS完全培養基700 μL , 于37 ℃細胞培養箱中培養24 h,然后將小室擦凈以除去殘留細胞,4%甲醛固定,0.5%結晶紫進行染色, 于倒置顯微鏡下隨機選取3個視野進行拍照,Image Pro Plus 6.0計數并統計結果。

1.2.5qRT-PCR檢測M0細胞、M1細胞CXCL10、CCR7、IL12 mRNA表達水平 細胞處理24 h,以TRIzol提取細胞中總RNA,按照Takara試劑盒說明書將其逆轉為cDNA。以逆轉好的cDNA為轉錄模板,qRT-PCR試劑盒和引物為試劑,按以下轉錄條件：預變性95 ℃ 30一個外循環;PCR反應階段是40個循環,每個循環為95 ℃ 、5 s和60 ℃ 、30 s進行PCR擴增反應,采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量。

1.2.6蛋白印跡檢測MCF-7細胞、T47D細胞、MDA-MB-231細胞E-cad、FN、Vim蛋白表達 細胞處理48 h;收集E-cad、FN、Vim蛋白;采用BCA試劑盒進行蛋白定量,樣品上樣,上層濃縮膠80 V、下層分離膠120 V至電泳結束;然后將分離蛋白轉移至PVDF膜;5% BSA室溫封閉2 h,后加入一抗4 ℃雜交12～16 h;再加入與一抗對應的二抗(1∶10 000),室溫雜交2 h;PVDF膜以化學發光試劑盒進行顯色,Syngene Imaging System進行凝膠成像,Quantity One對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 M1巨噬細胞驗證

如圖1所示,THP-1組細胞被活化后,M0巨噬細胞變成貼壁細胞,胞體變大;M1巨噬細胞胞體變成多邊形,并且觸角變多。以M0組為對照,M1組中CCR-7、CXCL-10和IL-12的mRNA及蛋白水平表達均上調,差異有統計學意義 (P<0.05或P<0.01)。表明M1巨噬細胞轉化成功。

注：A為細胞形態觀察,B為qRT-PCR實驗統計結果,C、D分別為Western blot實驗及對應統計結果;與M0組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.2 M1-CM促進ER+乳腺癌細胞遷移及侵襲

如圖2所示,與RPMI-1640組相比,MCF-7細胞M1-CM組遷移率及侵襲率增加,T47D細胞M1-CM組遷移率增加,差異有統計學意義(P<0.05)。提示M1-CM可增強ER+乳腺癌細胞MCF-7和T47D的遷移,以及MCF-7的侵襲能力。

注：A、E為傷口愈合實驗結果,B、F為傷口愈合實驗統計結果;C、F分別為Transwell實驗結果及其統計結果;(1)與RPMI-1640組相比,P<0.05。

2.3 M1-CM對ER-乳腺癌細胞遷移無明顯影響

如圖3所示,與RPMI-1640組相比,M1-CM組MDA-MB-231細胞無明顯遷移,差異無統計學意義(P>0.05)。綜上,M1-CM可促進ER+細胞的遷移及侵襲。

注：A、B分別為傷口愈合實驗及對應統計結果。

2.4 M1-CM誘導ER+乳腺癌細胞EMT標志物表達

如圖4所示：與RPMI-1640組比較,MCF-7細胞M1-CM組FN及Vim表達上調,同時E-cad蛋白表達下調,差異有統計學意義(P<0.05);與RPMI-1640組比較,T47D細胞M1-CM組FN及Vim蛋白表達上調,同時E-cad蛋白表達下調,差異有統計學意義 (P<0.05)。如圖4所示,MDA-MB-231細胞中,與RPMI-1640組比較,M1-CM組FN蛋白及Vim蛋白表達水平下調不明顯,差異無統計學意義(P>0.05);而E-cad蛋白表達上調 (P<0.05)。提示M1-CM可以促進ER+乳腺癌細胞的EMT。

注：A、C、E為Western blot實驗,B、D、F為對應統計結果;(1)與RPMI-1640組相比,P<0.05。

2.5 Calpeptin/Calpain InhibatorⅢ抑制M1-CM誘導的ER+乳腺癌細胞的遷移及侵襲

如圖5所示：與M1-CM組相比,MCF-7細胞M1-CM+ Calp組及M1-CM+CI Ⅲ組細胞遷移率下降,差異具有統計學意義 (P<0.05);與M1-CM組相比,MCF-7細胞M1-CM+ Calp組及M1-CM+CI Ⅲ組細胞遷移率下降,差異具有統計學意義 (P<0.05);與M1-CM組相比,T47D細胞M1-CM+ Calp組及M1-CM+CI Ⅲ組細胞遷移率下降,差異具有統計學意義 (P<0.05)。

注：A、C為傷口愈合實驗,E為Transwell實驗,B、D為傷口愈合實驗結果,F為Transwell實驗結果;(1)與RPMI-1640組相比,P<0.05;(2)與M1-CM組相比,P<0.05。

2.6 Calepetin/Calpain InhibatorⅢ抑制M1-CM誘導的ER+乳腺癌細胞EMT標志物的表達

如圖6所示：與M1-CM組相比,MCF-7細胞M1-CM+ Calp組及M1-CM+CI Ⅲ組FN蛋白表達水平下調,Vim蛋白表達水平下調,E-cad蛋白表達表達水平上調,差異具有統計學意義(P<0.05);與M1-CM組相比,T47D細胞M1-CM+Calp組及M1-CM+CI Ⅲ組FN蛋白表達水平下調,Vim蛋白表達水平下調,E-cad蛋白表達表達水平上調,差異具有統計學意義(P<0.05)。表明M1-CM促進ER+乳腺癌細胞EMT可能與Calpain途徑有關。

注：A、C為Western blot實驗,B、D為對應統計結果;(1)與RPMI-1640組相比,P<0.05;(2)與M1-CM組相比,P<0.05。

3 討論

盡管對乳腺癌的認識在不斷加深,但轉移性乳腺癌患者預后仍然很低下,平均5年生存率僅26%[9],所以理清乳腺癌細胞轉移的機制,有效預防和遏制腫瘤轉移,是提高乳腺癌患者生存率與生存質量的關鍵。乳腺癌是一種異質性疾病,按照ER可分為ER+和ER-兩類[10],與高侵襲性的ER-乳腺癌相比,ER+乳腺癌惡性程度較低[11],但也可被各種因素刺激而表現出浸潤轉移能力[12-13]。EMT在胚胎發育、傷口愈合以及腫瘤轉移中都發揮著重要作用[14]。在EMT過程中,上皮性腫瘤細胞的黏附和極性能力喪失,E-cad蛋白表達下調,并獲得間質特征,如FN和Vim蛋白上調,從而使乳腺癌在內的腫瘤細胞運動性和侵襲能力增強,為上皮來源的腫瘤細胞轉移提供主要動力[15]。M1巨噬細胞在傳統主要被視為潛在抗腫瘤靶標[16],但近來也有研究發現M1巨噬細胞具有促腫瘤效應,如M1巨噬細胞可以誘導卵巢癌[17]、胰腺腫瘤[18]等組織發生EMT,促進其遷移、侵襲而推進腫瘤的惡性演進。有報道顯示,M1巨噬細胞對乳腺癌細胞MCF-7上皮標志物E-cad蛋白表達沒有明顯影響,有助于轉移性乳腺癌細胞的休眠行為[19];也有文獻顯示乳腺癌細胞MCF-7經M1-CM處理之后,E-cad表達下調,轉錄因子slug、snail及NF-κB核表達上調[20],間質標志物FN表達上調[21],遷移、侵襲能力增強,可見M1巨噬細胞在乳腺癌EMT中的作用目前尚難以定論。

本研究是以人乳腺癌ER陽性細胞株MCF-7、T47D和ER陰性細胞株MDA-MB-231為研究對象,觀察M1-CM對對其遷移能力和侵襲能力的影響,結果顯示M1-CM可增強MCF-7細胞的遷移能力和侵襲能力,增強T47D細胞的遷移能力,但對ER陰性陰性細胞MDA-MB-231遷移能力無明顯影響,提示M1-CM誘導ER+乳腺癌細胞遷移及侵襲。進一步以Western blot觀察M1-CM對乳腺癌細胞EMT相關標志物表達影響,結果顯示M1-CM能明顯下調上皮標志物E-cad蛋白表達,同時上調間質標志物FN、Vim蛋白表達,但是對ER-細胞MDA-MB-231間質標志物無明顯下調,且上調上皮標志物E-cad表達,提示M1巨噬細胞條件培養液可促進ER+乳腺癌細胞EMT,但對ER陰性乳腺癌細胞無明顯影響。

在促炎性微環境中,巨噬細胞與雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ERα)陽性乳腺癌細胞之間的相互作用有利于TNF-α和IL-6等促炎性因子的表達,然后TNF-α和IL-6進一步通過其受體誘導NF-κB的激活[22],而TNF-α、IL-6及NF-κB信號傳導途徑,都是與腫瘤EMT高度相關的因素。綜上,M1-CM可誘導ER+乳腺癌細胞EMT,促進MCF-7細胞遷移、侵襲[20],從而為低轉移性ER+乳腺癌細胞遠處轉移提供可能性,其可能與M1促炎性巨噬細胞分泌的炎性因子有關。

Calpain是細胞內一種依賴Ca2+激活的半胱氨酸蛋白酶超家族,且可以被其內源性抑制劑蛋白酶抑制,目前在哺乳動物中被報道的就有16個家族成員,其中為μ-鈣蛋白酶(Calpain1)和m-鈣蛋白酶(Calpain2)最為常見。Calpain1和Calpain2都是異二聚體蛋白酶,含有相同的28 kDa調節亞基(CAPN-4)和不同的80 kDa催化亞基[23],。Calpain家族可以通過多種底物的蛋白水解而參與細胞骨架重塑、遷移、存活和凋亡等生物學活性[24]。大量體內和體外的研究表明,Calpain與乳腺癌的多種侵襲性表型有關,在體外敲除Calpain 2可損害乳腺癌細胞侵襲偽足的形成[25];Calpain1和Calpain2可以促進HER2+乳腺癌小鼠模型的腫瘤發生,并可增強癌細胞的耐藥性[26];Calpain可以通過介導FN誘導的乳腺癌EMT而參與腫瘤細胞遷移、侵襲和EMT過程[27]; Calpain還可以促進ER+乳腺癌的生長。但鮮少有資料表明Calpain與TAE之間的聯系,本實驗發現：M1-CM促進的ER+細胞系MCF-7和T47D的遷移及MCF-7細胞的侵襲可被Calpain抑制劑Calpeptin及Calpain Inhibitor Ⅲ抑制,進一步以Western blot檢測EMT相關標志物表達發現,M1-CM上調的ER+細胞系MCF-7和T47D的間質標志物FN及Vim表達被Calpain抑制劑抑制,M1-CM下調的上皮標志物E-cad蛋白表達被逆轉,表明Calpain信號也參與M1-CM介導ER+細胞系EMT的過程,說明Calpain不僅與乳腺癌本身密切相關,也同樣是TAE與乳腺癌細胞相互影響的橋梁。

綜上所述,M1巨噬細胞條件培養液具有誘導ER+乳腺癌細胞遷移、侵襲的能力,Calpeptin、Calpain InhibitoⅢ可以抑制該效應,提示M1巨噬細胞條件培養液可通過Calpain信號促進ER+乳腺癌EMT過程,為ER+乳腺癌細胞轉移提供可能性。