吡非尼酮對人肝星狀細胞LX2增殖、活化以及糖酵解途徑的影響*

李雪瑩, 姜虹羽, 張帥, 周石, 段慶紅

(1.貴州醫科大學 醫學影像學院, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學附屬腫瘤醫院 GCP機構辦公室, 貴州 貴陽 550001; 3.貴州醫科大學附屬腫瘤醫院 影像科, 貴州 貴陽 550001)

肝纖維化是繼發于多種慢性肝損傷的重要病理過程之一,是肝硬化和肝癌的前期疾病,及時干預肝纖維化是預防肝癌的重要手段[1]。肝臟慢性損傷的修復過程中,靜止于Disse空間的肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化啟動肝纖維化,肝內細胞外基質(extracellular matrix,ECM)異常增多和過度沉積,肝內正常組織被纖維瘢痕取代[2-4]。HSCs活化的過程需要大量能量的支持,研究發現活化型HSCs(activated hepatic stellate cells,aHSCs)能量代謝發生改變,細胞進行代謝重編程快速獲取大量能量,其增殖能力明顯增強、ECM產生增多[5-6]。靜息態HSCs 活化過程中有氧糖酵解增強,誘導大量乳酸產生,導致乳酸堆積[7],并且促進葡萄糖轉運體 1(glucose transporter 1,GLUT1)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2 isoform,PKM2)的高表達[8-9]。靶向HSCs 細胞活化時的能量代謝或許可以成為一個新的抗肝纖維化靶點。然而目前尚無基于病理生理學的抗肝纖維化藥物應用于臨床,尋找新的安全有效的抗肝纖維化藥物亟待解決。吡非尼酮(pirfenidone, PFD)是一種新型的小分子抗纖維化藥物,臨床上用于治療特發型肺纖維化并展現出較好的療效[10],但其具體機制尚不完全明晰。PFD服用后在人體及動物中吸收迅速并在肝、腎、肺等血流豐富器官中濃度較高[11]。基于藥物代謝特點,PFD有希望作為抗肝纖維化藥物。本研究以糖酵解途徑為著手點,探討PFD對轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導活化的人肝星狀細胞LX2的抗纖維化作用,為其治療肝纖維化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

人肝星狀細胞株LX2(上海富衡生物科技有限公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、高糖DMEM培養基(北京賽澳美細胞技術公司),青-鏈霉素(美國Hyclone公司),TGF-β1(美國Peprotech公司),吡非尼酮(北京康蒂尼藥業股份有限公司),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、4%多聚甲醛溶液、0.1%結晶紫染液、全蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),CCK-8試劑(上海陶術生物公司),葡萄糖檢測試劑盒(上海榮盛生物藥業公司),乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所),stain-free膠(美國Bio-Rad公司),BCA蛋白濃度定量試劑盒(上海碧云天生物技術公司),PVDF膜(美國Millipore公司),高敏ECL曝光液(北京四正柏生物科技有限公司),鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)單克隆抗體、兔抗人乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A, LDHA)單克隆抗體(美國Novus Biologicals公司),兔抗人膠原Ⅰ(collagenⅠ, COL1A1)單克隆抗體、兔抗人GLUT1單克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗人己糖激酶 2(hexokinase 2, HK2)單克隆抗體、兔抗人PKM2單克隆抗體(美國Cell signaling公司),鼠抗人血小板型磷酸果糖激酶(recombinant phosphofructokinase, platelet, PFKP)單克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司),兔抗人單羧酸轉運蛋白-1(monocarboxylate transporter 1, MCT1)多克隆抗體(上海愛必信生物科技有限公司),鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、兔抗人微管蛋白(tublin)單克隆抗體(美國Affinity公司),PCR所用引物序列由上海生工生物公司合成,Trizol試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司),PCR試劑盒(美國MCE公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養基分組 于37 ℃、5% CO2培養箱中,用含有10% FBS、100 000 U/L青-鏈霉素的高糖DMEM培養基培養LX2細胞,每2 d更換培養液,傳2～3代后用于后續實驗。設置6個組,分別為正常組(0.1 % DMSO)、對照組(10 μg/L TGF-β1+ 0.1 % DMSO)、實驗組(10 μg/L TGF-β1 + 2、4、6及8 mmol/L PFD)。每次鋪板LX2細胞貼壁后,用含1% FBS的DMEM培養液饑餓細胞24 h,加入含或不含10 μg/L TGF-β1的10% FBS的DMEM培養基刺激12 h,用相應藥物處理。

1.2.2CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 96 孔板內接種對數生長期LX2細胞,每孔約 5×103個細胞,按“1.2.1”中分組處理后分別培養12、24、36、48、60及72 h,每個組設置至少3個復孔。檢測時棄去培養基,每個孔加含10 %CCK-8溶液的無血清DMEM培養基,繼續在培養箱培養2 h,波長 450 nm 處檢測各孔吸光度,計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]× 100%。

1.2.3平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 6孔板中以100～200個 /孔的密度接種對數生長期LX2細胞,按“1.2.1”分組處理24 h后培養10～14 d,在顯微鏡下觀察可見克隆細胞團時,棄去培養基,PBS洗2次,4 %多聚甲醛溶液固定各組細胞20 min后,0.1 %結晶紫染色10 min,PBS反復清洗至無染液殘留,完全干燥后拍照計數。

1.2.4上清中葡萄糖及乳酸的測定 6孔板中以3×105/孔的密度接種對數生長期LX2細胞,按照“1.2.1”中分組處理后,分別于培養12、24、36、48、60及72 h時收集上清液離心,按葡萄糖測量劑盒說明加入檢測樣本、檢測試劑,充分混勻,37 ℃水浴中反應10 min,測定505 nm波長處吸光度值。培養液中葡萄糖濃度(mmol/L)=[(測定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標準孔吸光度-空白孔吸光度)]×5.5 mmol/L。按照乳酸測量劑盒說明加入樣本、酶工作液、顯色劑,混勻,37 ℃ 水浴中準確孵育 10 min,加入終止液,使用酶標儀測定530 nm波長處吸光度值,計算培養液中乳酸濃度。培養液中乳酸濃度=培養液中葡萄糖濃度(mmol/L)=[(測定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標準孔吸光度-空白孔吸光度)]×3 mmol/L×稀釋倍數。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測α-SMA、COL1A1、Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1的蛋白表達 收集各組細胞,加入裂解液裂解細胞,靜置后離心取上清,用 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。配制10 % SDS-PAGE 凝膠進行蛋白電泳,將蛋白質轉移到 PVDF 膜上,用快速封閉液室溫封閉15 min后,相應一抗 4 ℃ 搖床孵育過夜,次日用辣根過氧化物酶標記的IgG 二抗(稀釋比例1∶10 000)室溫孵育1 h,暗盒中與ECL孵育1 min后于Bio-Rad凝膠成像系統內曝光條帶。用Image J軟件分析目的條帶灰度。

1.2.6實時定量熒光PCR法(RT-qPCR)檢測α-SMA、COL1A1、Glut1、HK2、PKM2、LDHA的mRNA表達 Trizol法提取各組細胞RNA,測量總RNA 濃度,逆轉錄后以20 μL體系在PCR儀中擴增,引物序列見表1,擴增條件：95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸30 s,循環40次。

表1 引物序列表Tab.1 List of primer sequences

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PFD對TGF-β1刺激的LX2細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗表明(圖1A),與正常組相比,36 h時對照組的LX2細胞增殖率增高,差異有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,實驗組PFD處理36 h開始呈劑量依賴性降低TGF-β1刺激的LX2細胞增殖率,差異有統計學意義(P<0.05)。平板克隆形成實驗(圖1B、1C)中,對照組LX2細胞克隆數比正常組增多,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,實驗組LX2細胞克隆數呈時間-劑量依賴性降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為不同時間點CCK-8實驗結果,B、C為平板克隆形成實驗結果;(1)與同時點對照組比較,P<0.05。

2.2 PFD對TGF-β1刺激的LX2細胞活化的影響

與正常組比較,對照組中LX2細胞活化標志之一的α-SMA及細胞外基質重要組成的COL1A1蛋白表達水平升高,差異有統計學意義 (P<0.05);與對照組比較,實驗組中PFD以劑量依賴方式降低活化的LX2細胞α-SMA、COL1A1蛋白表達(P<0.05, 圖2A、2B)。RT-qPCR結果也顯示(圖2C),與正常組比較,對照組LX2細胞(-SMA及COL1A1 mRNA相對表達量增加,差異有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,實驗組LX2細胞在不同濃度PFD處理后,α-SMA及COL1A1 mRNA相對表達量呈劑量依賴性降低 (P<0.05)。

注：A、B為各組α-SMA、COL1A1蛋白電泳條帶和相對定量結果,C為各組α-SMA、COL1A1 mRNA相對表達水平;(1)與對照組比較,P<0.05。

2.3 PFD對TGF-β1刺激的LX2細胞外葡萄糖及乳酸水平的影響

葡萄糖及乳酸結果顯示(圖3),與正常組相比,對照組LX2細胞從36 h開始出現出現上清中葡萄糖水平降低,差異有統計學意義(P<0.05);同時上清中乳酸水平升高,且從48 h開始,與正常組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。實驗組LX2細胞在干預48 h時,其細胞外葡萄糖水平較同時點對照組升高,差異有統計學意義(P<0.05);除2 mmol/L組外,各組乳酸水平均較對照組降低,差異有統計學意義(P<0.05),以上改變表現出劑量依賴性。

2.4 PFD對TGF-β1刺激的LX2細胞糖酵解關鍵酶及相關蛋白的影響

Western blot結果(圖4A、4B)顯示,與正常組比較,對照組LX2細胞的Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1蛋白表達水平升高(P<0.05),實驗組LX2細胞的Glut1、HK2、PFKP、PKM2、LDHA、MCT1蛋白表達水平較對照組呈劑量依賴性降低(P<0.05)。RT-qPCR結果(圖4C)顯示,對照組Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA的相對表達量相比正常組增加(P<0.05),且這些相關基因的mRNA相對表達量也在實驗組中降低(P<0.05)。

注：A、B為各組糖酵解途徑關鍵酶及相關蛋白電泳條帶和蛋白相對定量結果,C為糖酵解途徑關鍵酶及相關蛋白的mRNA表達水平;(1)與對照組比較,P<0.05。

3 討論

作為肝硬化及肝癌的前期疾病,肝纖維化的病理過程在研究中被證明是可逆的[12]。HSCs是肝纖維化發生的重要響應細胞[4]。正常肝臟中的HSCs處于靜止狀態,胞內富含維生素A脂滴并且僅分泌少量ECM[13]。肝臟受到損傷后,HSCs下調維生素A,膠質纖維酸性蛋白和過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達,上調α-SMA的表達,成為活化的HSCs遷移到病理損傷處,大量分泌并積累以膠原為主的ECM,產生纖維瘢痕,取代受損的正常肝組織[14-16]。TGF-β1是目前已知最強的促纖維化因子,以Smad2/Smad3依賴的方式激活HSCs[17],活化后的HSCs增殖能力增強,ECM分泌增多。本實驗中CCK-8和平板克隆實驗顯示,通過TGF-β1刺激后的LX2細胞的增殖能力增加,并且PFD以時間-劑量依賴的方式抑制活化后的LX2細胞的增殖能力,提示PFD可以抑制LX2細胞的增殖和活性。TGF-β1刺激HSCs活化后,其活化標志α-SMA及ECM主要成分膠原Ⅰ的蛋白及mRNA表達上調,而在使用PFD后α-SMA、COL1A1蛋白及mRNA 表達降低,表明PFD能抑制HSCs的活化及ECM過度沉積, 從而達到干預肝纖維化的目的。

HSCs的活化是公認的肝纖維化產生的基礎,其活化狀態的發生和維持需要大量能量來維持。之前研究已證明活化的HSCs利用有氧糖酵解快速產能保持其高度增殖的需求,類似于腫瘤中的“Warburg”效應[18],同時持續的能量供應也為ECM的不斷產生提供了便利[7]。葡萄糖是糖酵解的反應底物,通過細胞膜上GLUT進入細胞內,在HK、PFK、PK、LDH等糖酵解酶的催化下生成乳酸,同時產生2分子ATP,乳酸在MCT催化下釋放[19-20]。本研究中對培養上清中代謝物的檢測顯示通過TGF-β1刺激后的LX2細胞葡萄糖消耗及胞外乳酸積累增多,并上調糖酵解關鍵酶及相關轉運蛋白的蛋白及mRNA表達,這些改變與有關報道HSCs有氧糖酵解增強時,葡萄糖、乳酸和糖酵解關鍵酶及相關蛋白的變化一致[7-8,21],這些改變可能與活化的HSCs進行代謝重編程有關。除在有氧情況下HSCs進行代謝重編程外,HSCs很可能也在同時存在缺氧的情況下進行無氧糖酵解,HSCs活化后大量分泌ECM,Disse空間或細胞外間隙中的Ⅳ型膠原被Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原取代[22],氧氣交換空間被壓縮,局部出現缺氧改變,細胞缺氧誘導缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1,HIF-1α)轉錄增強和穩定[23],HIF-1α可過表達GLUT、HK2、PKM2、LDHA等多種糖酵解相關蛋白和酶[24]。在既往研究中,姜黃素通過下調原代小鼠HSCs的HK2、PFK、GLUT4改善了小鼠肝纖維化[25],Mejias等[26]通過下調HSCs中PFKFP3降低糖酵解水平以抑制小鼠HSCs的活化,改善小鼠肝纖維化。本研究中PFD干預降低了TGF-β1刺激的LX2細胞葡萄糖消耗及胞外乳酸積累,同時下調LX2細胞糖酵解關鍵酶及相關轉運蛋白的表達,也表明PFD能下調活化的HSCs糖酵解水平,干擾HSCs的能量代謝,但其與HIF-1β關系如何及具體分子機制需在今后研究中驗證。

綜上所述, PFD可以抑制人HSCs的增殖、活化及ECM的過度沉積,起到抗肝纖維化作用。同時提示PFD抗肝纖維化作用可能與糖酵解水平下調、細胞能量代謝受擾相關,但其影響HSCs糖酵解的具體分子機制尚需進一步的研究。