氧化低密度脂蛋白對人臍靜脈內皮細胞增殖及 circRNA-CER表達的影響*

陳萬, 王小靜, 劉晗, 趙鄭波

(1.重慶市九龍坡區人民醫院 心內科, 重慶 400050; 2.重慶市九龍坡區人民醫院 神經內科, 重慶 400050; 3.重慶市渝北區中醫院 心內科, 重慶 401121)

動脈粥樣硬化是導致眾多心血管疾病的基礎病理改變,其發病率在世界范圍內呈逐年增加的趨勢,給全球經濟社會的發展帶來了嚴重的負擔[1]。目前臨床上主要通過降脂療法延緩疾病的進展,卻無法完全抑制或逆轉疾病的進程。因此探明動脈粥樣硬化的發病機制有助于為該病的防治提供新的診治靶點。動脈粥樣硬化的發病機制極為復雜,學術界中存在脂質浸潤、血管內皮損傷、血管平滑肌細胞過度增殖等多種假說。其中,血管內皮細胞損傷是誘導動脈粥樣硬化的始發因素,多項研究證實改善血管內皮功能具有抑制動脈粥樣硬化的作用,提示保護血管內皮細胞是一項潛在有效的抗動脈粥樣硬化治療策略[2]。CircRNA是一類含有共價閉環結構的RNA,具有表達豐度高、穩定性強(抵抗核酸外切酶)、保守性強、時空及組裝表達特異性等特點,因此可成為潛在的疾病生物標志物。CircRNA常以“海綿樣”作用吸附miRNA或與蛋白結合發揮生物學作用,近年來發現circRNA也可編碼蛋白或短肽,從而在生長發育、惡性腫瘤及心血管疾病等發病中發揮關鍵作用[3-5]。有研究報道,hsa_circ_0010729通過miR-186/HIF-1α調控軸影響血管內皮細胞的增殖和凋亡[6]。提示circRNA與血管內皮細胞的功能密切相關,其有望成為保護血管內皮細胞免受氧化低密度脂蛋白(oxidized lipoprotein, ox-LDL)的損害、抵抗動脈粥樣硬化發病的潛在新型靶點。本研究經前期篩選發現circRNA-CER在ox-LDL刺激下的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)表達明顯下調。然而,circRNA-CER在動脈粥樣硬化中對血管內皮細胞功能的調節作用和具體生物學機制還未完全闡明,其是否能成為診治動脈粥樣硬化的新靶點還有待進一步評估。本研究旨在探討circRNA-CER在ox-LDL的誘導下對血管內皮細胞增殖的影響以及其作為miRNA“分子海綿“機制的探討,以期為動脈粥樣硬化的靶向治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HUVEC購于武漢原生原代公司,胎牛血清購于Gibico公司,1640培養基購于Hyclon公司,ox-LDL購于廣州弈源生物。質粒由上海漢恒公司合成。miRNA-136 mimic及檢測試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司,LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司,CCK8購自MCE公司,TRIzol購于ThermoFisher公司,逆轉錄試劑、SYBR Green購于TAKARA公司。引物由生工設計并合成;RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、6X蛋白上樣緩沖液、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于碧云天公司;GAPDH、VEGF抗體購于武漢三鷹公司;熒光二抗購于LI-COR公司。

1.2 研究方法

1.2.1HUVEC細胞培養及處理 培養使用含有20%胎牛血清的1640培養基(Hyclon),放置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。待細胞匯合度為60%～70%時進行ox-LDL刺激、質粒或miRNA mimic轉染。ox-LDL按濃度梯度(0、40、60、80、100及200 mg/L)處理24 h或以100 mg/L按時間梯度(0、6、12、24及48 h)處理。后續實驗按照ox-LDL 100 mg/L處理細胞24 h。質粒轉染使用轉染試劑LipofectamineTM2000,按照說明書操作,6 h后換液。pcDNA3.1質粒作為對照組。

1.2.2qRT-PCR實驗 使用TRIzol法提取細胞總RNA,用一步法逆轉錄試劑按1 μg RNA反應體系進行逆轉錄,反應程序為：37 ℃ 15 min,85 ℃ 15 s。采用SYBR Green熒光染料進行實時定量PCR反應,程序為：95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共進行39個循環。每個樣品設置3個復孔。以GAPDH作為內參照。2-ΔΔCt法計算相對表達量。miRNA-136的檢測使用專用試劑盒。引物序列：CircRNA-CER 上游引物為5′ -CTGGTGCAGTGGAAGCAGAG-3′ ,下游引物為5′ - CGACCCTCCATTGCTCTTCT -3′;GAPDH 上游引物為5′ -GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游引物為5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA -3′。

1.2.3CCK8實驗 在96孔板中接種并處理細胞,檢測時加入CCK8溶液(10 μL/孔)和培養基(90 μL/孔),分別轉染pcDNA3.1對照組和circRNA-CER過表達質粒組。細胞培養箱中孵育2 h后,使用酶標儀測量吸光度OD450值。

1.2.4Western blot檢測 使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白,其中添加PMSF以防止蛋白降解,BCA法進行蛋白濃度的測定,加入6×蛋白上樣緩沖液,100 ℃加熱10 min。使用10% SDS-PAGE凝膠進行80 V恒壓電泳,將分離后的蛋白轉至NC膜,室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h,4℃孵育一抗GAPDH (1∶10 000)、VEGF (1∶500)過夜。復溫后用TBST緩沖液洗膜3次,避光并于室溫中孵育熒光二抗(1∶10 000)1 h,TBST緩沖液洗膜3次。LI-COR熒光成像儀中進行成像,通過Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.5熒光素酶報告基因 由上海漢恒生物科技有限公司分別構建circRNA-CER、VEGF 3′UTR熒光素酶報告基因質粒。在96孔板中接種細胞并進行miR-136 mimic處理,同時轉染circRNA-CER或VEGF 3′UTR報告質粒,以mimic NC處理作為對照。使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天)按操作說明進行檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CircRNA-CER在ox-LDL刺激下的血管內皮細胞中低表達

結果如圖1所示,ox-LDL對HUVEC中circRNA-CER的表達呈現濃度與時間的依賴性。隨ox-LDL濃度的增加,circRNA-CER表達呈下調趨勢,并在100 mg/L ox-LDL處理時差異有統計學意義(下降72.9%,P<0.05)。在以ox-LDL 100 mg/L刺激后發現,circRNA-CER表達隨處理時間延長呈下調趨勢,在24 h處發生下調(下降73.5%,P<0.05)。繼續加大ox-LDL濃度或延長處理時間對circRNA-CER的表達抑制影響有限。故circRNA-CER在100 mg/L ox-LDL處理HUVEC 24 h后表達下調最顯著,選擇以該濃度及時間作為后續實驗條件。

注：A為circRNA-CER在ox-LDL濃度梯度刺激24 h后的表達,B為circRNA-CER在ox-LDL 100 mg/L濃度下隨時間梯度的表達;(1)與0 mg/L ox-LDL組比較,P<0.05;(2)與0 h比較,P<0.05。

2.2 驗證circRNA-CER表達質粒效率

用circRNA-CER過表達質粒轉染HUVEC,以空載質粒作為對照。24 h后運用qRT-PCR檢測circRNA-CER的表達量。圖2結果顯示：過表達組中circRNA-CER的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。

2.3 過表達circRNA-CER阻止ox-LDL發揮抑制HUVEC增殖的作用

通過CCK8實驗檢測細胞增殖能力,結果如圖3所示,與對照組相比,ox-LDL處理組細胞在450 nm處OD值降低(P<0.05),而在ox-LDL刺激的同時過表達circRNA-CER可逆轉ox-LDL單獨處理引起的細胞增殖抑制效應。

2.4 CircRNA-CER結合miR-136影響VEGF表達

通過qRT-PCR檢測miR-136的細胞表達水平。圖4A結果顯示,過表達circRNA-CER后miR-136的表達量較對照組下調(下降53.3%,P<0.05);Western blot實驗證實,在circRNA-CER過表達的同時增加miR-136表達量可抑制單獨過表達circRNA-CER對VEGF蛋白表達的促進作用,提示circRNA-CER對 VEGF的表達調控受miR-136的影響(圖4B)。熒光素酶報告基因實驗結果顯示,circRNA-CER與miR-136以及miR-136與VEGF 3′UTR之間存在直接結合位點(圖4C)。

3 討論

作為miRNA發揮“分子海綿”樣作用是circRNA最早發現、研究最多的主要生物學功能之一[7]。circRNA具有與競爭性內源RNA(ceRNA)相似的作用機制,即通過“吸附”miRNA進而解除miRNA對下游靶基因的表達抑制,最終恢復靶基因的表達[8]。已有大量文獻報道,“circRNA-miRNA-靶基因”調控軸參與多種疾病的發病[9-12]。除此之外,circRNA與RNA結合蛋白的結合和相互作用是其另一大作用機制[13]。而新近發現的circRNA編碼蛋白進一步豐富了基因調控的多樣性[14-16]。而在血管形成和發育中,VEGF信號傳導發揮了關鍵的調控作用。VEGF誘導相關基因表達,調控血管的通透性并促進血管內皮細胞的遷移、增殖和存活[17]。有研究表明,在ox-LDL的損傷刺激下激活VEGF可發揮對血管內皮細胞的保護作用,從而起到抗動脈粥樣硬化的效果[18]。因此,探索調控VEGF表達的分子機制具體重要的意義。既往研究表明,部分circRNA例如circPDS5B、circRNA_06354可通過miRNA調控血管內皮細胞中VEGF的表達[19-20]。然而,其在ox-LDL導致的血管內皮細胞損傷的相關研究中卻機制不明。

本研究檢測到HUVEC在ox-LDL的濃度和時間梯度刺激下,細胞中circRNA-CER的表達呈下調趨勢。在構建并轉染circRNA-CER過表達質粒后,通過CCK8實驗發現,ox-LDL處理抑制HUVEC細胞增殖,而過表達circRNA-CER可消除該損傷效應,從而起到在動脈粥樣硬化中保護血管內皮細胞功能的作用。機制上,本研究還驗證circRNA-CER對VEGF的表達具有促進作用。隨后在篩選和驗證后發現circRNA-CER可抑制miR-136的表達,而在同時干預兩者后可阻斷circRNA-CER對VEGF的表達促進作用,提示circRNA-CER通過miR-136影響VEGF表達。通過熒光素酶報告基因,也進一步證明了circRNA-CER與miR-136以及miR-136與VEGF 3′UTR的直接結合,提示circRNA-CER可作為miR-136的“分子海綿“解除其對靶基因VEGF的表達抑制。

綜上所述,本研究發現 circRNA-CER在ox-LDL刺激下的血管內皮細胞中顯著下調表達,該分子能夠有效地抵抗ox-LDL對血管內皮細胞增殖的抑制作用,具有調控動脈粥樣硬化發病的潛能。circRNA-CER有望成為動脈粥樣硬化的新型診療靶點。除外,本研究后續將繼續完善分子研究并引入動物疾病模型,以期深入、全面的探討circRNA-CER在動脈粥樣硬化中的生物學作用和機制。