正常足月新生兒出生3個月內腸道菌群的定植規律分析*

張金鈴, 姜華, 楊萌婷, 馬麗, 雷光霞, 杜欣欣, 馮梅, 余涵, 王鑒***

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院, 貴州 貴陽 550000; 2.貴州醫科大學附屬醫院 小兒外科, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學附屬醫院 新生兒科, 貴州 貴陽 550004)

腸道菌群是人體最龐大、最復雜及最多樣化的微生物群,在調節營養、代謝、免疫和生理功能以維持宿主健康方面發揮重要作用[1],其中新生兒腸道菌群的最初定植和演替規律一直是重要研究課題[2-3]。正常足月兒是指胎齡為≥37～<42周、出生體質量為2 500～4 000 g及無畸形或疾病的活產嬰兒[4]。隨著測序技術的發展和進步,特別是檢測腸道菌群標記基因(如16S V3～V4區域)為對象的擴增子測序的廣泛應用,使得人體腸道菌群的鑒定駛上快速道,包括很多以往基于培養法無法檢測出來的菌群也能被很快鑒定出來[5]。然而,國內采用測序技術進行腸道菌群研究的報道不多,且結果差異較大[6-8],未能長期監測新生兒腸道菌群的演變過程[9]。因此,本研究運用16S 核糖體RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因測序技術動態監測正常足月新生兒腸道菌群的定植規律,探索正常足月新生兒出生3個月內腸道菌群變化,為新生兒腸道菌群與疾病的研究提供基礎數據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年11月1日—2022年4月30日本院分娩的正常足月新生兒,要求符合：(1)37周≤胎齡<42周,出生體質量≥2 500～≤4 000 g;(2)母親無感染性疾病、新生兒無感染高危因素;(3)未使用抗生素;(4)病歷資料、隨訪信息完整。排除有嚴重先天性消化道畸形及各種遺傳代謝病者、生后使用微生態制劑者。正常足月新生兒20例,男嬰10例(50.00%)、女嬰10例(50.00%),出生胎齡37+1～40+6周、平均(38.78±1.53)周,出生體質量2 550～4 000 g、平均(3 158.00±431.02)g,1 min Apgar評分9.00(9.00,9.00)分,5 min Apgar評分均為10分,喂養方式為配方奶喂養2例(10%)、母乳喂養7例(35%)及混合喂養11例(55%),剖宮產14例(70.00%)、經陰分娩6例(30.00%)。本研究獲醫院倫理委員會批準(2022倫審第339號),所有研究對象的家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料收集 查閱電子病例系統,收集孕母資料[年齡、孕產情況、無感染高危因素(母親絨毛膜羊膜炎或產時發熱、B族鏈球菌(Streptococcus)定植或菌尿癥或既往新生兒B族Streptococcus感染、胎膜早破≥18 h、自發性早產、羊水胎糞污染)]和足月新生兒資料(性別、胎齡、出生體質量,分娩方式及喂養方式)。

1.2.2糞便標本收集及菌群檢測 收集足月新生兒出生后第1天(C0)、第3天(C1)、第1周(C2)、第1個月(C3)及第3個月(C4)足夠的糞便標本至無菌螺口凍存管,糞便采集后即刻放入裝有冰袋的保溫盒中,-80 ℃冰箱冷凍保存,采集過程嚴格遵循無菌操作原則;所有標本收集完成后,干冰運輸至上海百趣生物醫學科技有限公司,進行l6S rRNA V3+V4區測序及生物信息學分析。

1.2.3l6S rRNA測序 首先采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)方法提取糞便標本總脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),之后選擇l6S rRNA V3+V4區域特定引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)805R(5′-GACTACHVGGG TATCTAATCC-3′),進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增、定量并回收純化,從而制備合格的測序文庫上機測序;在NovaSeq PE250平臺上進行16S rRNA基因測序。

1.2.4生物信息學分析 對測序獲得的雙端數據進行數據拆分、拼接和過濾、 采用區分擴增子降噪方程(divisive amplicon denoising algorithm 2,DADA2)去噪,獲得擴增子序列變異體(amplicon sequence variants, ASV)特征(feature)序列和ASV (feature)豐度表格。根據ASV(feature)序列文件、ASV (feature)豐度表進行物種注釋及計算各物種在各樣本中的豐度,主要看門、屬水平腸道菌群,觀察其分布情況;通過Alpha多樣性分析評估樣本中腸道菌群豐富度、多樣性(常用Chao1指數描述菌群豐富度,shannon、Simpson指數用于描述菌群多樣性);通過Beta多樣性分析對不同組間樣本腸道菌群構成進行比較分析[常用方法為主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA)]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 測序基本信息

20例正常足月兒5個時間點的樣本均齊全,共收集100份糞便標本進行l6S rRNA基因測序,測得的序列長度在400～500 bp,占總序列的99.80%,共鑒定出39個門和1 021個屬。

2.2 腸道菌群ASV分布

正常足月兒于C0、C1、C2、C3、C4時的糞便樣本中含有ASV數目依次為2 722、1 828、1 930、1 970及1 940個,即出生第1天ASV數目最多(圖1)。

注：綠色為C0,紅色為C1,黃色為C2,藍色為C3,紫色為C4,重疊部分為共有ASV數目。

2.3 腸道菌群Alpha多樣性分析

采用Shannon、Simpson、Chao1指數來度量正常足月新生兒腸道菌群Alpha多樣性(表1),結果顯示,5個采樣時間點的Shannon指數比較,差異有統計學意義(H=19.53,P<0.05),進一步做多重比較分析顯示正常足月新生兒C1、C2及C4的Shannon指數均低于C0時間點(Padj.<0.05);5個采樣時間點的Simpson指數比較,差異有統計學意義(H=12.66,P<0.05),進一步做多重比較分析顯示,5個采樣時間點的Simpson指數相互比較差異無統計學意義(Padj>0.05);5個采樣時間點的Chao1指數比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 正常足月兒出生后不同時間點糞便中腸道菌群的Alpha多樣性指數[M(P25,P75)]Tab.1 Alpha diversity index of intestinal flora in feces of normal term neonates at different time points after birth[M(P25,P75)]

2.4 腸道菌群的Beta多樣性

采用PCoA分析度量足月兒腸道菌群的Beta多樣性,結果顯示(圖2),C0樣本分布較為分散,提示差異較大;其他采樣時間點樣本間距離較近、分布較集中,提示差異較小。

注：紅色為C0,草黃色為C1,綠色為C2,藍色為C3,紫色為C4;每1個點代表1份樣本,相同的顏色代表同一采樣時間,兩點之間距離越近表示兩者的腸道菌群結構差異越小;橫縱坐標的百分比表示第一軸和第二軸對樣本差異的解釋度。

2.5 腸道菌群在門水平上的變化

所有樣本中腸道菌群主要以厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)及擬桿菌門(Bacteroidota)4個菌門為主,占樣本腸道菌群總數的95%以上,4種優勢菌門相對豐度在不同采樣時間點存在差異;正常足月新生兒生后3個月內Firmicutes相對豐度呈現先增加后降低的趨勢,Proteobacteria相對豐度由高變低再逐漸增高,Actinobacteriota相對豐度呈現逐漸增加趨勢、C4時與Proteobacteria共同成為優勢菌門,Bacteroidota相對豐度一直處于低豐度狀態。見表2。

表2 正常足月兒出生后不同時間點糞便中腸道菌群門水平的物種相對豐度Tab.2 Relative abundance of species at the level of the phylum intestinal flora in the feces of normal term neonates at different time points after birth

2.6 腸道菌群在屬水平上的變化

在屬水平,正常足月新生兒生后前3個月糞便標本中觀察到10種優勢菌屬,其中羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、Streptococcus、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)為主要菌屬,演變方向依次為：Ralstonia、Streptococcus、Bifidobacterium。另外,隨日齡增加,埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)相對豐度變化趨勢表現為先增加后降低,C3后處于穩定狀態;腸球菌屬(Enterococcus)C2、嗜甲基菌屬(Methyloversatilis)C1開始一直處于穩定低豐度狀態;狹窄梭菌屬-1(Clostridiumsensustricto-1)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、韋榮球菌屬(Veillonella)生后一直處于低豐度狀態。見表3。

表3 正常足月兒出生后不同時間點糞便中腸道菌群屬水平的物種相對豐度Tab.3 Relative abundance of species at the level of the genus intestinal flora in the feces of normal term neonates at different time points after birth

3 討論

學者們對人體腸道菌群的研究不僅僅局限于某種菌群的定植及其相對豐度比例,還會關注腸道菌群整體多樣性及動態變化情況,從而探討腸道菌群演替與人體健康、疾病的關系[10-11]。本研究對正常足月新生兒的糞便標本采用Illumina NovaSeq PE250進行16S rRNA基因測序,動態觀察腸道菌群定植及演變過程,探索其變化規律,為今后腸道菌群與疾病的研究提供基礎數據。16S rRNA基因V3～V4區域的DNA測序為當前研究腸道菌群的重要手段,無需分離培養細菌,便可對樣本中的優勢物種、稀有物種進行檢測,獲得腸道菌群組成、相對豐度、多樣性分析,但是16S rRNA測序得到的序列很多注釋不到種水平,且很難分析新的或高度分化的微生物,如病毒和真菌[12]。

本研究中,正常足月新生兒出生后C0時ASV數目最多,1個ASV代表1種菌群,故生后第1天菌群種類最豐富;5個采樣時間點之間的腸道菌群豐富度和多樣性存在差異,如Alpha多樣性分析的Shannon指數所示,C0的Shannon指數數值最大(Shannon指數越大,多樣性越高),即C0多樣性最高;5個采樣時間點樣本間構成情況進行比較,本研究通過腸道菌群PCoA分析顯示,C0樣本整體上分布較為分散、提示腸道菌群結構差異較大,其余時間點分布較集中、提示腸道菌群結構差異較小。以上結果表明,出生后新生兒腸道含有種類豐富的菌群,且5個采樣時間點的腸道菌群組成結構不同。

在門水平,正常足月新生兒出生3個月內以Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteriota及Bacteroidota為主,這一結果與Jia等[13]研究結果一致。本研究還觀察到新生兒糞便以Proteobacteria為主,相對豐度高達59.18%,從生后C1開始相對豐度逐漸下降,有向Firmicutes轉變的趨勢,可能與腸道內環境變化有關,這一結果與Chernikova等[14]研究結果一致。另外,母乳中的低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)、乳鐵蛋白等成分對Proteobacteria有抑制作用[15-16]。本研究中,正常足月新生兒生后母乳和混合喂養比例為90%,這也可能是Proteobacteria相對豐度降低的另一個原因。

在屬水平,本研究觀察到10種優勢菌屬,其中Ralstonia、Streptococcus及Bifidobacterium為主要菌屬,演變趨勢依次為Ralstonia、Streptococcus及Bifidobacterium3個階段。第1階段在生后C0以Ralstonia為主。Ralstonia是一種機會致病菌,經常與院內感染有關,是無菌生理鹽水、蒸餾水、雷尼替丁注射液及芬太尼麻醉劑的污染菌,可引起敗血癥、腦膜炎及脊髓炎等[17]。Lampropoulos 等[18]研究顯示,新生兒敗血癥中檢出了Ralstonia。本研究結果顯示,Ralstonia僅在正常足月新生兒C0時相對豐度檢出較高,其余時間點相對豐度均<2%,這可能與嬰兒出生環境及健康狀態有關。第2階段從C1開始持續至C3,以Streptococcus為主。關于Streptococcus在新生兒的研究,多集中在B型Streptococcus引起的肺炎和腦膜炎,但研究者發現一些Streptococcus是無害的,如新生兒吸入的人乳中含有Streptococcus[19],剖宮產兒以葡萄球菌屬、腸桿菌屬及Streptococcus多見[20]。本研究中正常足月新生兒的母乳喂養、剖宮產分娩占比較高,這可能是Streptococcus在C1～C3時相對豐度較高的原因。第3階段為C4時,Bifidobacterium占優勢地位,在生長過程中,足月兒從C1開始,Bifidobacterium相對豐度逐漸增加至C4時相對豐度高達44.18%,這可能與本研究中母乳喂養兒占比較大有關。出生后嬰兒喂養方式是推動早期腸道菌群定植和進化的主要因素,母乳喂養兒比配方奶喂養兒含有更豐富的Bifidobacterium,而配方奶喂養兒優勢腸道菌群則為Bacteroides、腸桿菌屬及梭狀桿菌屬[21-22];母乳中的HMOs含量豐富,能刺激Bifidobacterium及乳桿菌屬的增殖與生長[23];母乳中含有的生物活性成分,如免疫球蛋白分泌型IgA、Bifidobacterium因子、乳鐵蛋白、免疫活性細胞及溶菌酶等能為腸道Bifidobacterium、乳桿菌屬、Bacteroides等有益菌群的定植、生長創造有利條件[24]。Bifidobacterium為新生兒腸道成熟的標志,研究報道Bifidobacterium具有以下功能[25-27]：限制病原微生物在嬰兒腸道中的定植、增強腸道屏障功能、降解膳食纖維并提供必需的營養物質、具有抗炎特性。Bifidobacterium的這些作用對生命早期的健康意義重大。

綜上所述,本研究使用16S rRNA基因測序揭示了正常足月新生兒出生3個月內糞便中腸道菌群演替方向,即Ralstonia、Streptococcus及Bifidobacterium3個階段;隨著日齡的增加,菌群組成結構、菌群相對豐度發生變化,為今后腸道菌群與疾病的研究提供基礎數據。不過,本研究屬于觀察性研究,樣本量相對較少,有一定的局限性,較難進行喂養方式、分娩方式與腸道菌群的相關性分析,且研究處于初級階段,未涉及病毒、真菌的研究,因此,可以進一步擴大樣本量進行研究,以及進行更加深層次的基礎研究,比如進行宏基因組學的研究。