壯骨強(qiáng)肌方對去勢大鼠骨密度及IL-17的影響

東智卓瑪 楊彬彬 林適 唐子佳 吳建軍 譚國志 楊昊霖 趙瑞 楊東升 鐘業(yè)霖 萬雷 黃宏興*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510378

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一類骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降、脆性增加的全身性骨病,臨床常引發(fā)疼痛及骨折風(fēng)險(xiǎn)[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是中老年女性骨折的主要危險(xiǎn)因素,其發(fā)病以雌激素缺乏引發(fā)骨重建失衡為主要機(jī)制。研究認(rèn)為免疫狀態(tài)的變化亦參與了OP的發(fā)病機(jī)制,絕經(jīng)后婦女慢性低水平炎癥狀態(tài)可能間接影響骨代謝促進(jìn)PMOP的發(fā)生[2],其中Th17細(xì)胞作為輔助性T細(xì)胞亞型通過分泌細(xì)胞因子IL-17(interleukin-17)影響骨代謝[3-4]。OP抗骨質(zhì)疏松藥物治療按照不同骨折風(fēng)險(xiǎn)程度推薦分層治療,目前西醫(yī)主要治療藥物包括雙膦酸鹽、地舒單抗、降鈣素及雌激素等[5],盡管對OP的機(jī)制研究已拓展到免疫學(xué)領(lǐng)域,免疫調(diào)節(jié)制劑能否運(yùn)用于OP臨床治療還需要更多更深入的研究。然而,中醫(yī)整體觀指導(dǎo)下的辨證論治已將增強(qiáng)機(jī)體免疫實(shí)踐于OP的中醫(yī)治療中。

中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本,氣血生化之源,脾虛水谷失司,則衛(wèi)氣不充,抵御病邪能力下降,“四季脾旺不受邪”,脾氣充盛,則外邪不可犯、內(nèi)疾不能傳,與今之免疫學(xué)相通[6]。在OP中醫(yī)病機(jī)轉(zhuǎn)化中,脾虛與OP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。OP中醫(yī)歸為“骨痿”范疇,病機(jī)總體以肝腎陰虛、髓枯筋燥,脾腎陽虛、精虧失養(yǎng),氣滯血瘀、脈絡(luò)瘀阻為主,證型主要分為肝腎陰虛型、脾腎陽虛型及氣滯血瘀型三類[7-8],治以補(bǔ)肝益腎、益氣健脾、活血化瘀為法。壯骨強(qiáng)肌方是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院黃宏興教授臨床經(jīng)驗(yàn)協(xié)定膏方[9],用于治療OP脾腎陽虛型,功效以補(bǔ)腎健脾、壯骨強(qiáng)肌、活血止痛為長。本研究擬觀察壯骨強(qiáng)肌方對去卵巢大鼠骨密度及IL-17的影響,探討骨與免疫在PMOP疾病中的關(guān)系,同時(shí)為壯骨強(qiáng)肌方的臨床運(yùn)用補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:30只SPF級SD大鼠,6月齡,雌性,體重(343±20)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2018-0034。飼養(yǎng)條件:恒定溫度(23±3)℃,相對濕度(55±5)%,12 h光/12 h暗光照循環(huán),標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)顆粒飼料,自由飲水飲食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批通過,倫理審查號:20210922004。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物:壯骨強(qiáng)肌方組成藥物:黃芪30 g、丹參30 g、酒蓯蓉30 g、鹽杜仲25 g、山藥25 g、砂仁30 g、熟地黃25 g及鹿角膠20 g,實(shí)驗(yàn)用濃縮制劑含生藥量1 g/mL,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科代煎;阿侖膦酸鈉片劑(國藥準(zhǔn)字J20130085,批號U06983);戊巴比妥鈉(批號922L0314);注射用青霉素鈉(國藥準(zhǔn)字H3702008)。

1.1.3主要儀器與試劑:雙能X線骨密度儀(美國Hologic,Discovery A型S/N 88761,h Hi-Res),Micro-CT掃描儀(德國SkyScan1276),脫水機(jī)(中國武漢俊杰電子有限公司,JJ-12J),包埋機(jī)(中國武漢俊杰電子有限公司,JB-P5),病理切片機(jī)(中國上海徠卡儀器有限公司,RM2016),正置光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS,BX53),成像系統(tǒng)(日本尼康,Nikon DS-U3)。IL-17 antibody(Santa Cruz Biotechnology,sc-374218),IL-17A antibody(中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,26163-1-AP),大鼠白細(xì)胞介素17(IL-17)ELISA檢測試劑盒(江萊生物,JL20879),二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,10023418),HE染液(武漢皮諾飛生物科技有限公司),蘇木素染液(武漢皮諾飛生物科技有限公司,P0064),中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司/10004160)。

1.2 方法

1.2.1造模與評估:SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為Sham組(假手術(shù)組,n=9)和模型組(n=21)。術(shù)前禁食禁水12 h,3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉(40 mg/kg),麻醉成功后常規(guī)脫毛,術(shù)區(qū)消毒、鋪巾。大鼠經(jīng)背側(cè)部雙切口逐層分離皮下組織與肌層,找到卵巢,OVX組予雙側(cè)輸卵管結(jié)扎并卵巢切除,Sham組僅切除卵巢周圍等體積脂肪組織,術(shù)后各組大鼠腹腔注射青霉素鈉(8萬/只),連續(xù)3 d預(yù)防感染。造模12周后,Sham組和OVX組各隨機(jī)抽取3只大鼠檢測腰椎骨密度以驗(yàn)證造模,驗(yàn)證造模大鼠從實(shí)驗(yàn)剔除。

1.2.2分組與給藥:造模成功后,將模型組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為OVX組(模型對照組)、ZGQJ組(壯骨強(qiáng)肌方組)和Alen組(阿侖膦酸鈉組),每組6只。給藥劑量按照臨床人與大鼠體表面積換算公式計(jì)算(給藥量=臨床成人每日用藥量/60 kg×6.25)。臨床壯骨強(qiáng)肌方成人口服10～20 g,每日1～2次,故將20 g/d作為等效劑量,則ZGQJ組大鼠予以壯骨強(qiáng)肌方2.08 g/(kg·d)灌胃;阿侖膦酸鈉成人口服70 mg/周或10 mg/d,故將10 mg/d作為等效劑量,則Alen組大鼠予以阿侖膦酸鈉1.042 g/(kg·d)灌胃;OVX組和Sham組大鼠予以等體積生理鹽水灌胃。每周測量1次體重,各組連續(xù)給藥12周。

1.2.3樣本收集與處理:各組大鼠稱重后3%戊巴比妥鈉麻醉,采集腹主動脈血,血樣室溫靜置3 h后離心取上層血清,將血清分裝后液氮冷凍保存。取左下肢股骨及脛骨并4%多聚甲醛固定,取右下肢股骨及脛骨液氮冷凍保存,取脾臟稱重并4%多聚甲醛固定,以進(jìn)行下一步檢測。

1.2.4DEXA檢測腰椎骨密度:取材前,各組大鼠麻醉后進(jìn)行DEXA腰椎部位骨密度檢測,大鼠俯臥位。

1.2.5Micro-CT檢測脛骨骨微結(jié)構(gòu):固定于4%多聚甲醛的左下肢脛骨用Micro-CT掃描儀掃描,掃描參數(shù)設(shè)為:電壓70 kV,電流200 μA,分辨率10.14 μm,重建參數(shù)最大值0.058及最小值0.000 1。掃描獲得的CT數(shù)據(jù)運(yùn)用NRecon軟件重建三維圖像,DataViewer旋轉(zhuǎn)圖像,CTvox合成3D圖像,CTAn分析骨組織微結(jié)構(gòu)參數(shù),包括骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)及骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.2.6HE染色觀察股骨骨組織病理變化:棄4%多聚甲醛,清除軟組織,用10% EDTA脫鈣液脫鈣,每2 d更換新脫鈣液,視5 mL注射器針頭能刺入骨組織為脫鈣完全,繼而石蠟包埋,切片。切片烤片處理后依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精及純水中以脫蠟;放入蘇木素染液、純水、分化液、純水、返藍(lán)液及純水中以蘇木素染色;放入梯度酒精及伊紅染液以伊紅染色;放入無水乙醇、二甲苯以脫水,最后中性樹膠封片。各組股骨遠(yuǎn)端切片用正置光學(xué)顯微鏡選取相同視野拍照,用Image J軟件在每個(gè)視野中隨機(jī)框取長寬相同的5個(gè)部位描畫骨小梁并計(jì)算面積(用標(biāo)尺矯正)。

1.2.7血清炎癥因子IL-17表達(dá)水平:用ELISA法檢測血清IL-17表達(dá)水平,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.8免疫熒光染色觀察脛骨IL-17表達(dá)水平:石蠟包埋切片依次進(jìn)行脫蠟、微波抗原修復(fù)、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育及DAYI染核。

1.2.9HE染色觀察脾臟病理變化:染色步驟同上述骨組織切片HE染色。

1.2.10免疫組化觀察脾臟IL-17表達(dá)水平:石蠟包埋切片依次進(jìn)行脫蠟、檸檬酸修復(fù)液抗原修復(fù)、內(nèi)源性酶阻斷、封閉、一抗孵育、二抗孵育及DAB顯色,同時(shí)進(jìn)行蘇木素復(fù)染后封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理,本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,其中符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不符合正態(tài)分布用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示[M(P25～P75)]。兩樣本組間差異比較,符合正態(tài)分布用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),否則用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。多樣本組間差異比較,符合正態(tài)分布及方差齊性用單因素方差分析(one-way ANOVA),符合正態(tài)分布但不滿足方差齊性用Welch ANOVA,不符合正態(tài)分布則用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腰椎BMD比較

與Sham組比較,OVX組BMD降低(P<0.05),表明去卵巢骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功。與OVX組比較,ZGQJ組與Alen組BMD增高(P<0.05)。與ZGQJ組比較,Alen組BMD較高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腰椎骨密度比較(g/cm2)

2.2 各組大鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)

大鼠脛骨近端Micro-CT三維重建可見,對比Sham組,OVX組骨小梁數(shù)量減少,小梁間間隙增大,而ZGQJ組與Alen組明顯改善上述現(xiàn)象。定量分析驗(yàn)證對比Sham組,OVX組BV/TV及Tb.N降低(P<0.05),Tb.Sp增高(P<0.05);對比OVX組,ZGQJ組與Alen組BV/TV、Tb.N及Tb.Th增高(P<0.05),Tb.Sp降低(P<0.05);ZGQJ組與Alen組相比,Alen組BV/TV及Tb.N更高(P<0.05),Tb.Sp更低(P<0.05)。見圖1。

圖1 Micro-CT檢測脛骨骨微結(jié)構(gòu)

2.3 各組大鼠股骨HE染色

與Sham組比較,OVX組大鼠股骨骨小梁形態(tài)變細(xì),網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞,骨髓腔內(nèi)脂肪空泡增多,骨小梁面積減少(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組與Alen組骨小梁增粗,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯,骨小梁面積增多(P<0.05),ZGQJ組骨髓腔內(nèi)脂肪空泡明顯改善。與ZGQJ組比較,Alen組骨小梁面積較高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨HE染色

2.4 各組大鼠血清IL-17表達(dá)水平

與Sham組比較,OVX組大鼠血清IL-17表達(dá)增高(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組與Alen組血清IL-17水平較低(P<0.05)。ZGQJ組與Alen組對比無差別(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清IL-17表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠脛骨IL-17免疫熒光染色

免疫熒光染色可見各組大鼠脛骨髓腔內(nèi)組織細(xì)胞胞質(zhì)均有不同程度IL-17表達(dá)。與Sham組比較,OVX組大鼠脛骨IL-17表達(dá)增高(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組大鼠脛骨IL-17表達(dá)降低(P<0.05),Alen組對比無差別(P>0.05)。ZGQJ組大鼠脛骨IL-17表達(dá)較Alen組低(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠脛骨IL-17免疫熒光染色

2.6 各組大鼠脾臟組織病理及脾臟指數(shù)

Sham組大鼠脾臟紅髓與白髓交界明顯,脾小體結(jié)構(gòu)清晰,淋巴小結(jié)與動脈周圍淋巴鞘深淺分明,大抵呈圓形。與Sham組比較,OVX組與Alen組大鼠脾臟紅髓與白髓交界不清,脾小體形態(tài)不規(guī)則,呈條索狀。與OVX組比較,ZGQJ組大鼠脾臟脾小體形態(tài)規(guī)則,交界明顯,在病理結(jié)構(gòu)上明顯改善。

與Sham組比較,OVX組大鼠脾臟指數(shù)下降(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組大鼠脾臟指數(shù)提高(P<0.05)。ZGQJ組與Alen組無差別(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠脾臟組織HE染色

2.7 各組大鼠脾臟IL-17表達(dá)水平

各組大鼠脾臟均有不同程度IL-17表達(dá)。在Sham組呈淡黃色低表達(dá),與Sham組相比,OVX組呈棕褐色高表達(dá)(P<0.05)。與OVX組比較,ZGQJ組呈黃棕色低表達(dá)(P<0.05),Alen組對比無差別(P>0.05)。ZGQJ組大鼠脾臟IL-17表達(dá)較Alen組低(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠脾臟組織IL-17免疫組化染色

3 討論

腎為先天之本,主骨,生髓,促進(jìn)人體生長發(fā)育及生殖功能。《圣濟(jì)總錄》中言:“骨屬于腎,腎若虛損,則髓竭骨枯”,說明腎虛是OP發(fā)生發(fā)展的根本。《素問·上古天真論》中言:“女子四七筋骨堅(jiān)……七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭”,腎氣充盛則筋骨強(qiáng)健,隨著年齡增長腎氣漸趨衰竭至天癸竭,女性絕經(jīng)后精虧骨髓失養(yǎng)引發(fā)PMOP。脾作為后天之本,與OP的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)[10-11]。《脾胃論》中言:“脾胃虛弱……五臟之氣不生。脾病則下流乘腎,土克水,則骨乏無力,是為骨蝕,令人骨髓空虛”,脾主運(yùn)化以生氣血,脾氣充盛則水谷精微運(yùn)化有所主,氣血生化有源則五臟得以濡養(yǎng),腎精得以滋養(yǎng)則骨強(qiáng),脾氣虛弱則運(yùn)化失司,氣血生化乏源則五臟失養(yǎng),腎精失充則骨枯。《傷寒論·平脈法》中言:“寸口脈緩而遲,緩則陽氣長……遲則陰氣盛,骨髓生”,胃合衛(wèi)氣,衛(wèi)氣調(diào)和充盛于外則寸口脈緩,脾合營氣,營充血滿于內(nèi)則脈遲,脾胃強(qiáng)健,營衛(wèi)調(diào)和,陰陽相濟(jì),則骨髓生長。“女子五七,陽明脈衰,面始焦,發(fā)始墮”也能說明脾胃虛弱腎精失充在PMOP發(fā)生發(fā)展中的重要作用。因此OP的治療不能只著眼于補(bǔ)腎填精,補(bǔ)腎與健脾并重才是根本。本研究之壯骨強(qiáng)肌方以補(bǔ)腎健脾、壯骨強(qiáng)肌、活血止痛為長,研究結(jié)果顯示與OVX組比較,ZGQJ組腰椎BMD增高(P<0.05),脛骨BV/TV、Tb.N及Tb.Th增高(P<0.05)且Tb.Sp降低(P<0.05),股骨HE染色骨小梁面積增多(P<0.05)且髓腔內(nèi)脂肪空泡改善,表明壯骨強(qiáng)肌方具有增強(qiáng)去卵巢大鼠腰椎骨密度、改善脛骨及股骨骨小梁結(jié)構(gòu)的作用。

雌激素下降和骨骼對機(jī)械刺激產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)減弱是PMOP骨丟失的主要機(jī)制[12],隨著對PMOP發(fā)病機(jī)制的深入研究,許多研究表明免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的聯(lián)系,免疫細(xì)胞通過分泌各種炎性介質(zhì)直接或間接的調(diào)節(jié)骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的活動,反之,不同類型的骨細(xì)胞亦能影響免疫細(xì)胞的活性[13-15],如巨噬細(xì)胞的促炎表型M1型可促進(jìn)高活性氧環(huán)境的形成和破骨細(xì)胞因子TNF-a和IL-1β的釋放以促進(jìn)破骨細(xì)胞的發(fā)生,而抗炎表型M2型分泌TGF-β和IL-10等抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[16-18],雌激素缺乏可使M1型極化增強(qiáng)而M2型極化受損[19],PMOP患者中存在TNF-α和IL-1β因子水平增加的表型[2];樹突狀細(xì)胞可表達(dá)RANKL,產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1等以促進(jìn)形成[20],還可以直接分化為破骨細(xì)胞[21];中性粒細(xì)胞的過度活躍利于破骨細(xì)胞骨吸收,而雌激素可抑制中性粒細(xì)胞過度活化[22];活化的T細(xì)胞通過在PMOP中強(qiáng)表達(dá)RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞的發(fā)生[23];B細(xì)胞可產(chǎn)生RANKL以刺激破骨細(xì)胞的形成[24]。然而對免疫器官與骨代謝的研究較少,因此,本研究通過去卵巢大鼠脾臟HE染色觀察雌激素缺乏對最大的免疫器官脾的影響,研究結(jié)果顯示與Sham組比較,OVX組大鼠脾臟組織出現(xiàn)紅髓與白髓交界不清、脾小體形態(tài)不規(guī)則病理改變,脾臟指數(shù)下降(P<0.05)。在諸多免疫細(xì)胞中,CD4+T輔助(Th)細(xì)胞在骨重塑的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,根據(jù)細(xì)胞因子表達(dá)譜的不同分為Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞可通過產(chǎn)生TNF-α促進(jìn)破骨,還可通過產(chǎn)生IFN-γ抑制破骨,具有雙重作用;Th2細(xì)胞通過產(chǎn)生Il-4、IL-5和IL-13發(fā)揮抗炎及保護(hù)骨骼的作用;Treg細(xì)胞通過減少破骨細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮骨保護(hù)作用[25-26]。Th17細(xì)胞作為輔助性T細(xì)胞亞型中促破骨細(xì)胞亞型,其在骨重塑過程中的作用主要通過其分泌的特征性促炎因子IL-17產(chǎn)生。主流的觀點(diǎn)認(rèn)為IL-17通過上調(diào)破骨細(xì)胞前體上的RANK受體表達(dá)從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[27],阻斷IL-17通路對OVX小鼠骨丟失具有保護(hù)作用[28],條件性敲除破骨前體的IL-17A受體表現(xiàn)骨保護(hù)作用且破骨細(xì)胞形成減少[3],雌激素缺乏時(shí)Th17/Treg平衡被破壞[25],Th17細(xì)胞本身也可通過表達(dá)RANKL直接激活破骨細(xì)胞前體[29-31]。因此,本研究通過檢測去卵巢大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達(dá)水平,驗(yàn)證雌激素缺乏對IL-17表達(dá)的影響,研究結(jié)果顯示與Sham組比較,OVX組大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達(dá)增高(P<0.05),與既往研究結(jié)果一致。

中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本,氣血生化之源,《景岳全書》中言:“五臟中皆有脾氣”,脾氣充盛,水谷精微經(jīng)脾輸布全身,五臟得以濡養(yǎng)而各司其職,衛(wèi)氣得以充養(yǎng)而抵御外邪有力,外邪不可犯、內(nèi)疾不能傳則身體強(qiáng)健,與今之免疫學(xué)相通。因此,本研究通過中藥灌胃后去卵巢大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達(dá)水平檢測,觀察壯骨強(qiáng)肌方對去卵巢大鼠IL-17免疫的影響,研究結(jié)果顯示與OVX組比較,ZGQJ組大鼠血清、脛骨及脾臟IL-17表達(dá)降低(P<0.05)。同時(shí),ZGQJ組大鼠脾臟組織病理結(jié)構(gòu)明顯改善,脾臟指數(shù)提高(P<0.05),表明壯骨強(qiáng)肌方具有調(diào)節(jié)去卵巢大鼠IL-17表達(dá)及改善脾臟免疫功能作用。

綜上所述,去卵巢大鼠存在骨密度降低及骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞等骨重建失衡改變的同時(shí),免疫系統(tǒng)也受到不同程度影響。中藥壯骨強(qiáng)肌方具有提高去卵巢大鼠腰椎骨密度,改善脛骨及股骨骨小梁結(jié)構(gòu),降低IL-17表達(dá),改善脾臟免疫功能作用,為其臨床運(yùn)用提供了一定科學(xué)依據(jù)。