接骨木治療骨質疏松癥的活性成分及作用機制研究

郭盼 郭慶梅* 姚俊修 吳德軍

1.山東中醫藥大學,山東 濟南 250355

2.山東省林業科學研究院/山東省林木遺傳改良重點實驗室,山東 濟南 250014

接骨木(SambucuswilliamsiiHance),又名扦扦活、九節風、續骨木、木蒴藋,為忍冬科接骨木屬多年生落葉灌木或小喬木。接骨木始載于唐代《新修本草》,藥性平和,味甘苦,歸肝經,有續筋接骨、祛風利濕、活血止痛的功效,可用于治療骨折腫痛、跌打損傷、外傷出血等疾病[1]。現代研究表明接骨木的活性成分包括木脂素類、環烯醚萜類、黃酮及黃酮苷類、酚酸類等,有抗骨質疏松、抗病毒、鎮痛、促進骨折愈合等藥理作用[1-2]。

隨著人口老齡化程度的加劇,骨質疏松癥逐漸成為世界范圍內常見的骨骼疾病之一,傳統醫學認為骨質疏松癥屬“骨痿”“骨枯”等范疇,腎虛精虧,加之正虛邪侵及先天不足等因素,以致骨骼失養,骨量減少,骨折風險增加[3];現代醫學研究顯示其發病機制為成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收失衡。主要表現為骨量減少、骨強度降低、骨微結構破壞、骨脆性增加及骨折風險增加[4]。目前用于治療骨質疏松癥的藥物有雙膦酸鹽骨吸收抑制劑、雌激素和選擇性雌激素受體調節劑、降血鈣素、組織蛋白酶K抑制劑、分子靶向藥物、成骨藥物、解偶聯劑-雷尼酸鍶和中藥單體活性成分[5],但患者長期使用雌激素、雙膦酸鹽等部分西藥后,患骨壞死、血栓、乳腺癌等疾病的概率會增加[6-7],因此尋找安全性高、毒副作用小的藥物治療骨質疏松癥非常必要。近年來研究發現接骨木莖枝提取物具有較強的抗骨質疏松活性,而且接骨木治療不會使大鼠的子宮重量增加,與雌激素替代療法治療骨質疏松癥相比,減少了卵巢癌、乳腺癌等疾病發病的風險[2]。因此,探究接骨木提取物治療骨質疏松癥的活性成分及機制,可能會發現新的安全性更高的藥物。本研究總結了國內外關于接骨木治療骨質疏松癥的活性成分和作用機制的最新研究進展,為進一步開發利用接骨木提供參考。

1 接骨木治療骨質疏松癥的活性成分

接骨木治療骨質疏松癥的研究主要集中于木脂素類、酚酸類、三萜類和黃酮類。其中以8-O-4' norlignan為主的8-O-4'類木脂素、以香草酸和阿魏酸為主的酚酸類、以白樺脂酸為主的三萜類、以葛根素為主的黃酮類均具有抗骨質疏松的活性。

1.1 木脂素類

接骨木中的木脂素具有抗骨質疏松、抗真菌、抗癌等藥理作用[8-9]。近年來,接骨木中的木脂素類化合物在治療骨質疏松癥方面的研究得到了重視,研究人員發現木脂素可以預防卵巢切除術導致的大鼠骨質疏松,抑制骨密度降低,增加骨強度[8]。目前研究顯示木脂素通過促進成骨細胞的增殖分化、抑制破骨細胞的生成和調控OPG/RANKL/RANK信號通路及MAPK非基因組ER途徑等發揮抗骨質疏松作用[8,10-11]。

利用大孔樹脂對接骨木莖枝60%乙醇提取物進行洗脫,研究不同洗脫物對骨質疏松的影響,結果表明50%和95%乙醇洗脫物抗骨質疏松活性最強,并且這兩個洗脫物(因95%乙醇洗脫物的產率很低,以下稱為接骨木50%乙醇洗脫物)主要為木脂素類,說明木脂素類有較強的抗骨質疏松作用[11]。在去卵巢(ovariectomized,OVX)致骨質疏松SD大鼠模型中,接骨木50%乙醇洗脫物在劑量為228 mg/kg時顯著增加了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)mRNA、骨鈣素(bone glaprotein,BGP)mRNA及runt相關轉錄因子(runt related transcription factor 2,Runx2)mRNA的表達,同時降低抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)mRNA和組織蛋白酶K(cathepsin K,Ctsk)mRNA的表達,并且能通過增加骨小梁數量、骨連接密度及骨體積/總體積,減少骨小梁分離及降低結構模型指數,減弱OVX大鼠誘導的骨密度降低和骨小梁微結構的破壞;228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脫物也可通過增大屈服應力、屈服位移、極限荷載及模量等骨力學參數,顯著抑制OVX大鼠骨強度的降低[8]。在OVX致骨質疏松C57BL/6J小鼠模型中,500 mg/kg和1 000 mg/kg的接骨木莖枝60%乙醇提取物顯著降低尿鈣含量,并提高血清鈣水平,從而促進成骨細胞的礦化,且接骨木莖枝60%乙醇提取物治療后,OVX小鼠的骨小梁數量增加及骨小梁分離減少[12]。1 000 mg/kg的接骨木莖枝60%乙醇提取物顯著增加了核心結合因子α1(core binding factor α1,Cbfa 1)mRNA的表達,且該劑量下的骨密度、骨連接密度和骨小梁厚度增加[12]。8-O-4' norlignan{(7R,8 S)-1-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-propane-diol,PPD}作為接骨木抗骨質疏松作用的活性成分,在一定的濃度范圍(10-12～10-8mol/L)顯著增加了小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1和大鼠骨肉瘤細胞UMR106的增殖;在10-9mol/L和10-8mol/L時,顯著促進了MC3T3-E1細胞和UMR 106細胞的ALP活性;10-8mol/L的PPD增加了ALP mRNA、BGP mRNA的表達及促進骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的鈣沉積;在濃度為10-10mol/L和10-8mol/L時,PPD上調了Runx2 mRNA和骨保護素(osteoprotegerin,OPG) mRNA表達水平,并通過調控MAPK介導的非基因組雌激素受體(estrogen receptor,ER)信號通路發揮治療骨質疏松作用[10]。

1.2 酚酸類

接骨木中酚酸類化合物也具有治療骨質疏松癥的作用,其可以促進成骨細胞的增殖,調控MAPK及OPG/RANKL/RANK等信號通路發揮保護作用。酚酸類抗骨質疏松活性的代表性成分有香草酸和阿魏酸。

一定濃度范圍內(10-12～10-8mol/L)的香草酸(vanilic acid,VA)能刺激UMR106細胞增殖,10-8mol/L的VA上調UMR106細胞中ALP mRNA和OPG mRNA表達水平及增加BMSCs中的鈣沉積,10-12mol/L的VA顯著增加MC3T3-E1細胞的ALP活性,10-10mol/L和10-8mol/L的VA可增加UMR106細胞中BGP mRNA、Runx2 mRNA的表達和OPG/RANKL比例以及通過調控MAPK介導的非基因組ER信號通路,發揮治療骨質疏松癥的作用[13]。

在OVX致骨質疏松SD大鼠模型中,20 mg/kg 阿魏酸(ferulic acid,FA)能使骨小梁數量和連接增加,極限載荷和彈性模量升高,從而改善股骨生物力學性能[14]。氧化應激是導致骨質疏松的因素之一,FA能修復氧化應激導致的大鼠成骨細胞鈣化結節數量減少及OPG等成骨功能相關基因表達水平的降低,從而恢復成骨細胞的增殖分化能力[15]。綜上,FA能夠在治療骨質疏松癥方面發揮作用,接下來的研究需要進一步證實阿魏酸的體內有效性與安全性,以期為抗骨質疏松藥物的研發提供相關依據。

1.3 三萜類

白樺脂酸(betulinic acid,BA)是三萜類發揮抗骨質疏松作用的活性成分,目前研究表明BA主要通過抑制破骨細胞分化起到治療骨質疏松的作用[16]。在骨髓巨髓細胞中,10 μmol/mL的BA明顯下調了TRAP基因的表達,從而抑制核因子-κβ受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)誘導的破骨細胞分化;同濃度的BA也調控破骨細胞分化過程中的MAPK、c-Fos及NFATc1信號通路,抑制ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化及c-Fos轉錄因子和活化T細胞核轉錄因子c1的表達,從而抑制破骨細胞分化,發揮抗骨質疏松作用[16]。另外,在小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7中,接骨木莖枝60%乙醇提取物在劑量為1、10、100 μg/mL時,能夠減少破骨細胞生成的數量,且在10 μg/mL時作用最佳[12]。因此接骨木三萜類可以直接調節破骨細胞的分化,發揮抗骨質疏松作用。

1.4 黃酮類

在鏈脲佐菌素誘發的昆明小鼠骨質疏松實驗中,與模型組相比,200 mg/kg和400 mg/kg的接骨木葉總黃酮提取物顯著升高了血清鈣和ALP水平,并降低P、TRAP及BGP水平,且總黃酮組的骨小梁增厚、骨密度增加、骨基質增多、成骨細胞數目增多及破骨細胞減少[17]。另外在維甲酸所致小鼠骨質疏松模型中,161 mg/kg和322 mg/kg的接骨木葉總黃酮提取物顯著升高了血清鈣及ALP水平,并且降低P、BGP及TRAP水平[18],以上結果表明接骨木葉總黃酮提取物對鏈脲佐菌素和維甲酸誘發的小鼠骨質疏松,均有一定的治療效果。但研究建立的骨質疏松模型具有局限性,且相關機制研究較匱乏,筆者認為今后有必要通過體內外實驗對接骨木葉抗骨質疏松的具體作用通路深入探究,為接骨木葉治療骨質疏松提供理論依據。

在C57BL/6小鼠骨質疏松實驗中,與OVX組相比,葛根素組骨小梁增多,骨髓腔變小,股骨組織結構更致密;葛根素上調了PTEN、Catalase及Foxo1的基因表達,其作用機制可能與PTEN-PI3K-AKT通路有關[19]。Ctsk是蛋白水解酶,能降解I型膠原蛋白,在骨吸收階段發揮作用[20]。有研究發現,10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L的葛根素下調了TRAP mRNA及Ctsk mRNA表達,從而顯著抑制破骨細胞的分化[21]。在OVX致骨質疏松Wistar大鼠模型中,35 mg/kg的葛根素顯著升高了血清Ca、P水平,并且改善了OVX大鼠的骨組織結構,表現為骨小梁數量增多,骨皮質變厚,髓腔明顯縮小等骨組織形態學參數的改變[22]。以上主要活性成分的相關化學結構見圖1。

圖1 接骨木中具有抗骨質疏松作用的化合物結構

2 接骨木治療骨質疏松癥的機制研究

MAPK有4個亞族:ERK、p38、JNK和ERK5,根據亞族的不同組成了4條不同的MAPK通路,其中ERK MAPK通路是調節成骨細胞分化與骨形成的重要信號傳導途徑[23]。OPG/RANKL/RANK系統在調控骨代謝上有重要作用,接骨木通過調節OPG/RANKL系統抑制破骨細胞的生成,進而抑制骨吸收[2]。OPG/RANKL/RANK信號通路和ERK MAPK非基因組ER信號通路在骨的形成和吸收上有一定的影響,目前研究已證明這幾條信號通路與接骨木治療骨質疏松有關。

2.1 OPG/RANKL/RANK信號通路

OPG、RANKL和核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)均是腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)受體超家族成員,其中OPG和RANK均是RANKL的受體,RANKL和RANK結合會促進破骨細胞分化,而OPG可以阻礙RANKL和RANK相互作用,競爭性結合RANKL抑制破骨細胞的產生[24]。體外UMR106細胞培養實驗可知,接骨木莖枝60%乙醇提取物能顯著上調UMR106細胞中OPG mRNA的表達以及下調RANKL mRNA的表達[2]。體內研究OVX C57BL/6J小鼠脛骨實驗[12]中,1 000 mg/kg接骨木莖枝60%乙醇提取物抑制了雌激素缺乏導致的OPG/RANKL的降低。綜上,接骨木在體內外均通過上調OPG/RANKL mRNA表達比值抑制骨吸收,從而發揮抗骨質疏松作用。

2.2 ERK MAPK非基因組ER信號通路

雌激素可以通過經典的ER途徑和MAPK非基因組ER途徑介導轉錄作用[25]。接骨木活性成分中的VA和PPD是植物雌激素,可以在成骨細胞中發揮雌激素樣作用,肖輝輝等[10,13]對PPD及VA分別進行研究,結果發現二者均上調了ERK磷酸化及ERα的磷酸化位點絲氨酸118的表達,說明接骨木通過激活ERK MAPK非基因組ER信號通路來抑制骨質疏松的發生。接骨木治療骨質疏松癥的作用機制如圖2。

圖2 接骨木治療骨質疏松的作用機制

3 接骨木治療骨質疏松癥的可能機制

大多數生理功能是由多個器官共同調節的,如骨骼的代謝與胃腸道等器官的調節密切相關[26-27],因此接骨木保護骨骼健康,可能與全身性代謝途徑和某些潛在的代謝物有關。有研究報道了接骨木50%乙醇洗脫物治療后,OVX大鼠的脂質、氨基酸、色氨酸等代謝產物發生了顯著變化,推測這些代謝物可能參與了接骨木的抗骨質疏松作用[8,28]。

3.1 氨基酸代謝途徑

支鏈氨基酸(branched chain amino acids,BCAA),尤其其中的亮氨酸,能增加骨小梁密度,對骨形成發揮正向作用[29-30]。色氨酸分為L和D兩種,L-色氨酸能對成骨細胞的分化起作用[31]。在OVX老年大鼠模型中,228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脫物能上調BCAA和色氨酸水平[8],并且代謝組學分析表明,糞便中的酪氨酸和色氨酸代謝以及血液中的BCAA降解和骨質疏松癥顯著相關[32],因此氨基酸代謝可能有助于接骨木的抗骨質疏松作用。

色氨酸的代謝途徑有兩條,代謝物分別為犬尿氨酸和血清素,血清素又稱5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),根據合成部位的不同可分為腸源性血清素和腦源性血清素,合成腸源性血清素占全身的95%[33]。血清素不能透過血腦屏障,因此外周5-HT主要是腸源性血清素。腸源性血清素可以通過5-HTR1b/CREB/Cyclins信號級聯來抑制成骨細胞增殖,叉頭框轉錄因子1(forkhead box O1,FOXO1)與成骨細胞的CREB和轉錄激活因子4(activating transcription factor-4,ATF4)有關。與OVX組相比,140 mg/kg接骨木50%乙醇洗脫物顯著上調了FOXO1的蛋白表達及下調ATF4的蛋白表達,從而減少了FOXO1與ATF4的相互作用,同時增加了FOXO1與CREB的作用,最終起到促進骨形成的效果[28]。色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase-1,TPH-1)是合成外周5-HT的限速合成酶,接骨木50%乙醇洗脫物對TPH-1高表達細胞進行體外處理,發現1 μg/mL的接骨木50%乙醇洗脫物顯著降低了TPH-1 mRNA和蛋白的表達,抑制5-HT的合成[8]。Xiao等[28]在此基礎之上,進行體內動物實驗,發現在OVX致骨質疏松SD大鼠模型中,140 mg/kg接骨木50%乙醇洗脫物能顯著抑制結腸中TPH-1蛋白的表達,從而顯著降低了OVX大鼠的血清5-HT水平。腸道微生物可以調節腸道粘膜內5-HT的合成,并且其中的瘤胃菌科UGC-014和糞桿菌真核菌群與大鼠骨密度呈負相關,140 mg/kg接骨木50%乙醇洗脫物能顯著降低瘤胃菌科UGC-014和糞桿菌真核菌群的豐度,抑制5-HT的合成,使OVX大鼠骨密度增加[28]。接下來可以探究接骨木中的主要木脂素對腸道微生物群和5-HT合成的調節作用,進一步證實木脂素的抗骨質疏松作用。

3.2 脂質代謝途徑

骨骼的健康與脂肪的不飽和指數有關,飽和脂肪酸能利用非特異性過氧化作用生成活性氧,活性氧的積累會導致骨髓細胞的脂毒性,從而起到抑制成骨細胞的增殖和分化作用[34]。研究表明228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脫物上調了花生四烯酸、亞油酸和油酸這3種不飽和脂肪酸的水平,意味著228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脫物處理可能加速脂質從飽和脂肪酸向不飽和脂肪酸的代謝,因此脂質代謝可能是接骨木治療骨質疏松癥的重要代謝途徑之一[8]。

3.3 抗氧化作用的介導

相比于OVX組,在使用228 mg/kg的接骨木50%乙醇洗脫物處理大鼠后,抗氧化劑血清尿酸水平得到恢復,超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平升高,對甲酚硫酸鹽誘導活性氧產生的作用及氧化應激標記物丙二醛水平的增加受到抑制,氧化作用減弱,這表明接骨木50%乙醇洗脫物治療骨質疏松癥的作用很可能與抗氧化系統的介導有關[8]。接骨木治療骨質疏松癥的可能機制如圖3。

圖3 接骨木治療骨質疏松癥的可能機制[8]

4 結語

國內外研究表明接骨木能夠治療骨質疏松和骨折,有較強的骨保護作用,這與古籍記載的接骨木續筋接骨的功效相一致。對接骨木發揮骨保護作用的有效部位研究主要集中在莖枝和根皮,葉和果實僅有少量研究。其中接骨木根皮在治療骨折方面有良好的活性,接骨木莖枝和葉在治療骨質疏松癥方面有較好的藥理效果,此外接骨木果實中的紅景天苷和蘆丁均有一定的成骨作用,說明接骨木果實具有治療骨質疏松癥的潛力[35]。接骨木莖枝中含有多種治療骨質疏松癥的成分,比如木脂素類、酚酸類、三萜類,其中木脂素類和酚酸類能通過影響成骨細胞和破骨細胞標志物的表達及調控ERK MAPK通路等,多途徑調節來減少骨質疏松的發生。木脂素通過上調ALP、OPG和Runx2的mRNA水平及下調Ctsk和TRAP的mRNA水平來刺激成骨細胞的分化、抑制破骨細胞的生成;通過增加OPG/RANKL,調節OPG/RANKL/RANK信號通路抑制破骨細胞生成;通過上調ERK磷酸化及增加ERα的磷酸化位點絲氨酸118的表達,調控ERK MAPK非基因組ER信號通路促進成骨細胞的增殖、分化。另外,在全身性代謝過程中,木脂素類治療骨質疏松可能與氨基酸代謝、脂質代謝的潛在代謝物有關。

盡管現代研究對接骨木及其活性成分在抗骨質疏松方面的研究已不斷深入,但仍存在以下問題:(1)對接骨木葉和果實治療骨質疏松癥的相關研究較少。在后期的實驗研究中,可以比較接骨木莖枝和葉治療骨質疏松癥的效果及對接骨木果實進行藥效學驗證,為接骨木葉和果實的深入研究提供依據;(2)目前對接骨木抗骨質疏松作用的研究大多基于體外細胞實驗和體內動物實驗,缺乏相關的臨床研究,且PPD、VA等接骨木活性成分的作用機制研究仍停留在體外實驗,其量-效-毒關系及成藥性也尚未系統闡述。后期應加強對接骨木治療骨質疏松癥的臨床實驗研究,同時對活性成分治療骨質疏松癥的作用進行體內有效性及安全性評價,為接骨木進入臨床治療骨質疏松癥奠定基礎;(3)接骨木治療骨質疏松癥的信號通路缺少深入系統性研究,且不夠全面,中藥多途徑、多靶點的特點決定了接骨木治療骨質疏松癥的信號通路應有多條,其復雜性與交叉性可能是未來研究的重點與難點。后續對于接骨木治療骨質疏松癥的信號通路應進行全面系統性研究,為中醫藥治療骨質疏松癥提供強有力的科學證據。