端粒酶、γ-干擾素、腺苷酸脫氨酶及結核感染T 細胞斑點試驗在診斷結核性和惡性胸腔積液中的作用分析

由振華，黃錦宏，趙云根，顧宇平，程易，凌春華

胸腔積液是胸膜疾病常見的臨床表現，而結核性胸膜炎和腫瘤均可引起胸腔積液［1］。這2 種疾病的治療方式截然不同，因此胸腔積液的病因診斷對疾病的治療至關重要［2］。胸腔積液中是否有結核分枝桿菌是診斷的金標準，但是由于其不易檢出，需反復抽取胸腔積液測定，患者依從性差［3］。近20 年來，隨著分子生物學的迅速發展，細胞因子被越來越多地應用于各種疾病的診斷，如感染性疾病、腫瘤及免疫性疾病等。端粒酶是一種備受關注的腫瘤標志物，其在惡性腫瘤組織中的表達活性明顯增強［4］；γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）是診斷結核性疾病的重要細胞因子之一，其可通過增強巨噬細胞的吞噬活性而在結核性疾病的免疫調節中發揮重要作用［5］；腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase， ADA）是一種催化腺苷酸脫氨基生成鳥苷的酶，已經被用于結核性胸膜炎的診斷［6］；T 細胞斑點試驗（T cell spot test， T-SPOT.TB）對于各種結核性疾病的診斷有著極高的敏感度和特異度，已被廣泛應用于臨床，是結核性胸膜炎主要的診斷措施之一［7］。本研究擬選取端粒酶、IFN-γ、ADA 及結核T-SPOT.TB 4 個診斷指標，探索聯合應用的診斷價值，以期為胸腔積液的鑒別診斷提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017 年1 月至2020 年12 月在常熟市第二人民醫院治療的80 例胸腔積液患者作為研究對象。其中結核性胸腔積液患者40 例，男性患者17 例，女性患者23 例；年齡30～68 歲［（51.29 ± 6.80）歲］；惡性胸腔積液40 例，男性18 例，女性22 例；年齡33～65 歲［（53.04 ± 6.48）歲］。2 組患者的性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 結核組與腫瘤組患者一般資料比較

1.2 診斷、納入與排除標準 結核性胸膜炎診斷依據中華醫學會《臨床診療指南·結核病分冊》［8］中的相關診斷標準。其中合并肺結核4 例，其他均為單純結核性胸膜炎。惡性胸腔積液診斷標準：經胸腔穿刺、內科胸腔鏡、纖維支氣管鏡等檢查，取得病理組織（包括胸水），送檢病理科，病理組織見癌細胞，惡性胸腔積液診斷明確，否認結核病史和結核病接觸史。其中肺腺癌24 例，肺小細胞癌7 例，肺鱗狀細胞癌5 例，其他類型肺癌4 例 。排除病毒感染者、免疫性疾病患者、嚴重肝腎功能損害者和孕婦。

1.3 標本采集 患者入院24 h 內查體和影像學檢查胸腔積液，治療前空腹抽取患者血液5 ml 和采用胸腔穿刺針抽取積液15 ml，隨后以3 000 r/min 離心10 min，離心半徑為30 cm，取上清液置于-80 °C中備用。并應用Ficoll 分離法分離外周血單個核細胞，備用。

1.4 檢測方法及結果判定 應用酶聯免疫吸附分析法分別檢測端粒酶的含量和IFN-γ 的濃度，應用比色分析法檢測ADA 的活性，使用北京百奧萊博科技有限公司提供的試劑盒；應用T-SPOT.TB 試劑盒檢測T-SPOT.TB 陽性率，T-SPOT.TB 檢測原理是檢測外周血中單個核細胞中的效應T 細胞，其判斷標準：當陰性對照孔斑點數為0～5 個時，任意1 個試驗孔的斑點數減去陰性對照孔斑點數大于等于6，判為陽性；當陰性對照孔斑點數為6～10 個時，任意1 個試驗孔的斑點數大于等于陰性對照孔斑點數的2 倍，判為陽性。

1.5 統計學處理 使用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。計量數據均行正態分布和方差齊性檢驗，以±s 表示，采用t檢驗；計數資料以例數和百分比（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核組與腫瘤組患者胸腔積液中端粒酶、IFNγ、ADA 比較 結核組和腫瘤組的端粒酶含量分別為（1.46 ± 0.73）×10-3nmol/L 和（3.34 ± 1.72）×10-3nmol/L，差異有統計學意義（P＜0.01）；結核組和腫瘤組的IFN-γ 含量分別為（137.44 ± 38.93） U/L和（27.94 ± 8.46） U/L，差異有統計學意義（P＜0.01）。結核組和腫瘤組的ADA 含量分別為（68.42 ± 9.58） U/L 和（15.39 ± 4.43） U/L，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 結核組與腫瘤組胸腔積液中端粒酶、IFN-γ、ADA 比較（±s）

表2 結核組與腫瘤組胸腔積液中端粒酶、IFN-γ、ADA 比較（±s）

注：IFN-γ 為γ-干擾素，ADA 為腺苷酸脫氨酶

組別結核組腫瘤組t 值P 值IFN-γ（ng/L）137.44 ± 38.93 27.94 ± 8.46 17.384＜0.001 ADA（U/L）68.42 ± 9.58 15.39 ± 4.43 31.777＜0.001例數40 40端粒酶（nmol/L）（1.46 ± 0.73）×10-3（3.34 ± 1.72）×10-3 6.363＜0.001

2.2 腫瘤組與結核組端粒酶、IFN-γ、ADA 和TSPOT.TB 陽性率比較 根據試劑盒說明書，端粒酶濃度小于2.0×10-3nmol/L 則判斷為陰性，結核組中端粒酶的陰性率（36 例，90.00%）高于腫瘤組（4 例，10.00%），差異有統計學意義（P＜0.01）；根據試劑盒說明書，IFN-γ 高于100 ng/L 判斷為陽性，結核組中IFN-γ 的陽性率（34 例，85.00%）高于腫瘤組（6 例，15.00%），差異有統計學意義（P＜0.01）；根據試劑盒說明書，ADA 高于45 U/L 判斷為陽性，結核組中ADA 的陽性率（36 例，90.00%）高于腫瘤組（5 例，12.50%），差異有統計學意義（P＜0.01）；結核組中T-SPOT.TB 陽性35 例，陰性5 例，陽性率為87.50%；腫瘤組中T-SPOT.TB 陽性3 例，陰性37 例，陽性率為7.50%。結核組T-SPOT.TB 的陽性率高于腫瘤組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 結核組與腫瘤組端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 陽性率比較［例（%）， n=40］

2.3 端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 單項與聯合檢測的敏感度、特異度和準確度分析 端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 聯合檢測鑒別結核性胸腔積液與惡性胸腔積液的敏感度、特異度和準確度均高于4 項指標單項檢測。見表4。

表4 端粒酶、IFN-γ、ADA 和T-SPOT.TB 單項與聯合應用診斷的敏感度、特異度和準確度（%）

3 討論

胸腔積液是臨床上常見病、多發病，如今胸腔積液的鑒別主要是針對結核性和惡性胸腔積液［8-9］。結核性和惡性胸腔積液的治療方案及預后均有著極大的差別。因此，對于兩者的鑒別診斷具有重要的臨床意義。目前，細菌學檢查是診斷結核性胸腔積液的金標準，而病理學檢查是診斷惡性胸腔積液的金標準，但是細菌學檢查和病理學檢查均存在陽性率低以及檢測耗時長等不足［10］。因此，本研究聯合應用端粒酶、IFN-γ、ADA、T-SPOT.TB 4 種診斷指標來鑒別2 種胸腔積液，探索聯合應用以上4 種診斷指標的診斷試驗在鑒別結核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的價值，以期為臨床工作中胸腔積液的鑒別診斷提供幫助。

端粒酶作為一種核糖核酸蛋白酶，可以自身RNA 為模板合成端粒DNA，使得端粒延伸并維持其穩定性［11］。端粒酶可將端粒DNA 加至真核細胞染色體末端，填補因DNA 復制而損失的端粒，使端粒修復延長，可以讓端粒不會因細胞分裂而有所損耗，使得細胞分裂的次數增加。端粒在不同物種細胞中對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒（縮短的端粒其細胞復制能力受限），從而增強體外細胞的增殖能力。端粒酶在保持端粒穩定、細胞長期的活性、基因組完整和潛在的繼續增殖能力等方面有重要作用。目前研究發現，端粒酶在正常人體組織中的活性被抑制，其長度隨著細胞分裂的進行而縮短。然而，端粒酶的活性在腫瘤細胞中被重新激活，使得腫瘤細胞可以逃避衰老［12］，從而參與惡性腫瘤的發生發展。參與腫瘤惡性轉化的端粒酶成為目前最常用的腫瘤分子標志物之一。本研究結果顯示，結核組胸腔積液中的端粒酶含量低于腫瘤組，差異有統計學意義；當端粒酶低于2.0×10-3nmol/L 時結果判斷為陰性，根據此標準，結核組和腫瘤組中端粒酶的陰性患者分別為36 例和4 例，結核組中端粒酶的陰性率高于腫瘤組。劉然等［13］和程江濤等［14］研究均發現結核性胸腔積液中端粒酶的含量和陽性率低于惡性胸腔積液，與本研究結果一致。

IFN-γ 屬于一種分泌蛋白，具有調節免疫系統的作用［15-16］。IFN-γ 主要通過促進巨噬細胞對抗原呈遞及增強巨噬細胞的胞內殺菌能力而起到抗結核免疫調節的作用。結核性胸腔積液中IFN-γ 的水平高于非結核性的胸腔積液。陳林［17］研究發現，結核性胸腔積液中的IFN-γ 水平高于惡性胸腔積液，IFN-γ 水平對于結核性胸膜炎診斷的敏感度為90.3%、特異度為79.5%；孫冰等［18］研究發現，與包括白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）、IL-4 在內的其他6 種細胞因子相比，IFN-γ 對結核性胸腔積液的敏感度、特異度和準確度均最高。本研究結果顯示，結核組的IFN-γ 水平高于腫瘤組，差異有統計學意義；結核組IFN-γ 的陽性率為85.00%，而腫瘤組的陽性率為15.00%，結核組IFN-γ 的陽性率高于腫瘤組，與既往的研究結果相一致［17］。當發生結核性胸膜炎時，結核抗原的刺激會引起胸腔積液中CD4+T 細胞反應明顯增加。CD4+T 細胞是細胞因子IFN-γ 的直接來源，因此，胸腔積液中的IFN-γ 水平明顯增高。

ADA 是一種嘌呤核苷分解代謝中的重要酶類，較早應用在臨床上診斷結核性胸膜炎，其在淋巴細胞尤其是T 淋巴細胞中含量高于其他細胞組織［19］。臨床上胸腔積液中ADA 大于40 U/L 提示為結核性胸腔積液的可能性較高。結核性胸膜炎的細胞免疫反應以T 淋巴細胞為主，因此，胸腔積液中ADA的含量可被用于結核性胸膜炎的診斷［20］。黃曉磊等［21］研究發現，結核性胸腔積液組患者中ADA 含量高于惡性胸腔積液組，ADA 含量對結核性胸膜炎診斷的敏感度和特異度均達到了75% 以上。本研究中結核組患者胸腔積液中的ADA 含量高于腫瘤組，結核組和腫瘤組胸腔積液中ADA 的陽性率分別為90.00% 和12.50%，ADA 在結核組中的陽性率高于腫瘤組。T-SPOT.TB 是一種運用IGRA 技術，檢測被結核分支桿菌特異的早期分泌靶抗原6和培養濾液蛋白10 分別刺激后釋放IFN-γ 的效應T 淋巴細胞，以輔助診斷結核感染的一種實驗室檢測技術。該技術從單個細胞水平上檢測分泌抗體細胞的數量，且不受細胞因子代謝的干擾。因此，該檢測方法可以準確地反映體內細胞因子的水平。試驗結果用每25 萬個外周血單個核細胞中斑點形成細胞的數目來判定陰陽性結果。通過對斑點形成細胞的計數來評估機體是否存在結核桿菌感染，已成為診斷結核性疾病的重要方法之一。大量研究發現T-SPOT.TB 對于肺外結核的診斷具有高度敏感性，在臨床上具有重要的診斷和鑒別診斷價值［22-26］。本研究結果顯示，結核組中患者T-SPOT.T的陽性率高于腫瘤組（87.50%vs.7.50%），且差異有統計學意義。

4 結論

端粒酶、IFN-γ、ADA、T-SPOT.TB 的單獨檢測在結核性胸腔積液和惡性胸腔積液的診斷及鑒別診斷方面具有重要的臨床參考價值，同時發現4 項指標聯合檢測的準確度、特異度和敏感度均達到了97.50%，均高于任何一項單獨檢測的敏感度、特異度和準確度。說明四者在鑒別結核性和惡性胸腔積液中具有互補性，4 項聯合檢測在結核性和惡性胸腔積液鑒別診斷中具有重要價值，值得臨床推廣。本研究不足之處在于沒有將其他疾病如心力衰竭、感染、結締組織病等疾病引起的胸腔積液及其相關指標納入研究檢測范圍，有待于進一步對其他病因的胸腔積液共同分析，為臨床對胸腔積液的診斷提供更全面的參考。