高效液相色譜法測定柴桂解表顆粒中黃芩苷含量的研究

成程，陳向梅，馬健，張沂

柴桂解表顆粒是一種純中藥制劑，主要的功效是表里雙解、清熱解毒，由解放軍總醫院第六醫學中心（原海軍總醫院）研發，是該院非標準制劑，主要中藥成分有黃芩、麻黃、桂枝、白芍、柴胡等，臨床上用來治療急性上呼吸道感染［1］，證屬衛分受寒，肺有蘊熱，癥狀可見發熱、頭痛、咽痛、鼻塞、流涕等。該制劑已建立的質量分析方法包括主要藥味桂枝、黃芩、麻黃和甘草的薄層鑒別，指標成分芍藥苷的含量測定等［1-2］。為進一步完善柴桂解表顆粒的質量標準，本研究參考2015 年版《中國藥典》［3］及黃芩苷相關檢測文獻［4-5］建立柴桂解表顆粒中黃芩苷含量的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）測定方法，該方法靈敏、準確，可取代黃芩薄層色譜鑒別作為柴桂解表顆粒質量標準之一。

1 材料與方法

1.1 儀器

1200 高效液相色譜儀、VWD 檢測器和HP 二維化學工作站，均為美國安捷倫公司產品；紫外可見分光光度計（日本島津，型號UV-2450）；電子分析天平（上海梅特勒托利多公司，型號PL203）。

1.2 試劑

黃芩苷標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號為110715-201318，供含量測定用，含量以93.3% 計）；柴桂解表顆粒樣品由解放軍總醫院第六醫學研究中心（原海軍總醫院）提供（3 批次的批號分別為：20141015、20150201、20150425）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為自制超純水。

1.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）；流速為1.0 ml/min；進樣量為5 μl；柱溫：40 ℃，檢測波長為335 nm［6］。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液的制備 取黃芩苷標準品適量，60 ℃減壓干燥4 h，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含黃芩苷40 μg 的溶液作為對照品。

1.4.2 供試品溶液的制備 準備供試品溶液之前，分別對取樣量、溶劑、提取溶劑量、提取方法做選擇實驗。測定結果確定供試品的取樣量為0.4 g時單位重量峰面積最大，見表1。不同溶劑提取測定結果表明70%乙醇提取效果較好，見表2。提取溶劑量的選擇結果表明70% 乙醇50 ml 能將有效成分提取完全，見表3。提取方法的選擇結果表明選用超聲20 min 的提取方法處理效果比較好且簡單，見表4。供試品溶液制備：精密稱定研細后的柴桂解表顆粒樣品0.4 g，置于200 ml 具塞錐形瓶中，精密加入70% 乙醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）20 min。放至室溫后再稱定重量，減失的重量用70% 乙醇補足，搖勻后過濾，濾液即為供試品溶液。

表1 不同取樣量提取后的測定結果

表2 不同溶劑提取測定結果

表3 不同乙醇量提取后測定結果

表4 不同提取方法測定結果

1.4.3 陰性對照品溶液制備 依照柴桂解表顆粒處方中各味中藥的比例，去掉黃芩，按其工藝制成陰性制劑，按1.4.2 節的方法制備陰性對照品溶液。

1.5 統計學處理

數據采用Excel 軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 系統適用性

分別取對照品、供試品和陰性對照品溶液各5 μl 進樣，分別進行HPLC 分析，記錄色譜圖，見圖1。在供試品的色譜圖上，與對照品對應的位置上有色譜峰出現，主峰與其他成分分離良好。陰性對照品的色譜圖中，在相應的出峰時間處無干擾峰出現，系統適用性良好。

圖1 黃芩苷對照品、柴桂解表顆粒供試品和陰性對照品HPLC 色譜圖

2.2 考察線性關系

精密稱取黃芩苷標準品10.95 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成408.7 μg/ml 的溶液，作為對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、5.0 ml 置于5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液各5 μl，進樣測定。以峰面積為縱坐標，黃芩苷進樣量為橫坐標，回歸得標準曲線方程為：y=2 693x-4.98，相關系數r=1，這表明黃芩苷在0.045 87～2.293 50 μg/ml 范圍色譜峰面積和進樣量呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗

精密吸取8.17 μg/ml 黃芩苷對照品溶液5 μl，進行HPLC 測定，記錄峰面積。重復測定6 次，計算得相對標準偏差（RSD）=0.3%，說明儀器精密度良好。

2.4 重復性試驗

精密稱取20150425 批次柴桂解表顆粒樣品6 份，分別制備供試品溶液，進行HPLC 分析，記錄HPLC 峰面積。黃芩苷含量平均為4.36 mg/g，RSD=1.33%，說明本方法重復性良好。見表5。

表5 重復性試驗測定結果

2.5 加樣回收率試驗

精密稱取20150425 柴桂解表顆粒（黃芩苷含量4.36 mg/g）樣品0.16、0.20、0.24 g，每個重量各3 份，分別精密加入適量的黃芩苷標準品。按供試品溶液的制備方法制備加樣回收測定溶液，HPLC測定其黃芩苷含量，并計算回收率，回收率為97.85%～101.68%，平均為99.6%，加樣回收良好。見表6。

表6 加樣回收率試驗結果

2.6 流動相比例的選擇

流動相選用甲醇-磷酸-水（45∶0.2∶55），甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53），甲醇-磷酸-水（49∶0.2∶51），見圖2～4。最終選定甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）的流動相系統，可使黃芩苷達到基線分離。

圖2 流動相甲醇-磷酸-水（45∶0.2∶55）

圖3 流動相甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）

圖4 流動相甲醇-磷酸-水（49∶0.2∶51）

2.7 樣品測定

不同色譜柱的比較，選用了2 種色譜柱進行比較：Discovery C18Cat#：504971 HPLC Column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）和 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm），見圖5、6。由圖可見C18色譜柱均能很好地使黃芩苷達到基線分離，方法學驗證采用的是Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）色譜柱。

圖5 色譜柱Discovery C18 Cat #：504971 HPLC Column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）

分別取柴桂解表顆粒3 個批次的樣品，制備供試品溶液。取每個批次的供試品溶液5 μl 進樣分析，計算黃芩苷含量，結果見表7。3 批柴桂解表顆粒中的黃芩苷含量分別為4.07、4.11、4.40 mg/g，初步制定柴桂解表顆粒質量分析標準中的黃芩苷含量為4～4.5 mg/g。

表7 樣品中黃芩苷含量測定結果

3 討論

黃芩是柴桂解表顆粒中的主要成分，黃芩苷也是主要功能成分之一。在前期制定柴桂解表顆粒質量標準的過程中，由于提取工藝的原因，未能從黃芩中提取出黃芩苷，只能用漢黃芩素作為對照品對黃芩進行薄層色譜鑒定［1］。本試驗對黃芩的提取工藝進行了研究，比較了純甲醇、80% 甲醇、純乙醇、70%乙醇、50%乙醇的提取效果，試驗結果表明70% 乙醇提取黃芩苷的效果較好。以70% 乙醇為溶劑，提取方法分別采用加熱回流30、60、120 min，超聲20、30、60 min，結果表明選用超聲20 min 的方法提取率較高。柴桂解表顆粒樣品溶于70% 乙醇中，超聲提取20 min 后可提取出黃芩苷用于HPLC檢測。

經過專屬性試驗、線性關系考察、精密度試驗、重復性試驗、加樣回收率試驗等方法學考察，結果顯示HPLC 用于柴桂解表顆粒中黃芩苷含量的測定，結果準確可靠，操作簡便易行，可以作為柴桂解表顆粒質量標準使用。