妊娠合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清miR-21的相對(duì)表達(dá)水平及臨床意義

何小琴,劉玢含,王 英△

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,四川成都 610041;2.四川大學(xué)華西護(hù)理學(xué)院,四川成都 610041

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種典型的自身免疫性疾病,其特點(diǎn)是產(chǎn)生自身抗體、沉積免疫復(fù)合物而帶來(lái)多器官功能損害[1]。SLE的臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性,涉及血液、腎臟、神經(jīng)等系統(tǒng),使得治療和管理變得困難和復(fù)雜[2]。目前,SLE的診斷主要基于一系列臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),如皮膚紅斑、關(guān)節(jié)痛、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4和抗雙鏈DNA抗體等[3]。由于目前SLE評(píng)估方法的復(fù)雜性、滯后性和侵襲性,研究人員正在尋找新的遺傳生物標(biāo)志物,以期開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)單、快速和客觀的指標(biāo),更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)SLE患者的病情轉(zhuǎn)歸和臨床結(jié)局[2]。

SLE好發(fā)于育齡期女性群體,可引起多種不良妊娠結(jié)局,如流產(chǎn)、宮內(nèi)死胎與胎兒發(fā)育阻滯等,但經(jīng)過(guò)病情評(píng)估、孕前診斷、免疫治療等措施,妊娠結(jié)局可得到改善[4]。因此,尋找能更方便、準(zhǔn)確地反映妊娠合并SLE(pSLE)患者疾病活動(dòng)的指標(biāo)將為病情控制和妊娠結(jié)局改善提供幫助。外泌體可由各種類型的細(xì)胞分泌至細(xì)胞外并進(jìn)入循環(huán),其包含的微小RNA(miRNA)可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的基因表達(dá),在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用,產(chǎn)生局部旁分泌或遠(yuǎn)端效應(yīng),也被認(rèn)為是重要的生物標(biāo)志物[5-6]。有研究報(bào)道,miRNA在SLE病程發(fā)展及早期診斷中具有重要作用[7-8]。本研究采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)pSLE患者血清miRNA(miR)-21的表達(dá)水平,將患者其他血液指標(biāo)與miR-21水平進(jìn)行相關(guān)分析,旨在探究miR-21與pSLE患者病情活動(dòng)的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 通過(guò)電子病例系統(tǒng),選取四川大學(xué)華西醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)2021年6月至2023年6月診斷為pSLE的48例患者,將其納入pSLE組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合2019年歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟與美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)關(guān)于SLE的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(2)妊娠3～8個(gè)月;(3)處于疾病活躍期;(4)入院前未采用其他藥物治療;(5)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他慢性疾病;(2)合并其他自身免疫性疾病;(3)其他原因造成器官損害;(4)合并妊娠高血壓或妊娠糖尿病。采用SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)-2000對(duì)SLEDAI進(jìn)行評(píng)價(jià),根據(jù)SLEDAI評(píng)分將pSLE組患者分為低活動(dòng)組(SLEDAI評(píng)分為1～9分)和高活動(dòng)組(SLEDAI評(píng)分>9分)。另選取同時(shí)期于本院體檢的30例健康妊娠期女性作為健康對(duì)照組。pSLE組與健康對(duì)照組的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、孕次、文化程度和收入水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見(jiàn)表1。本研究獲得患者知情同意及本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)[23年審(1405)號(hào)] 。

1.2方法

1.2.1外泌體及RNA提取 使用美國(guó)MCE血清外泌體分離試劑盒分離血清外泌體:抽取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL,將血清置于4 ℃環(huán)境下,以3 000×g離心10 min后取上清液,重復(fù)2次。取1 mL離心后的上清液,加入3 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS),再加入1 mL BPS,渦旋,并在4 ℃環(huán)境中靜置2 h,再以10 000×g離心 60 min,棄上清液,向沉淀物中加入0.5 mL PBS并充分重懸。重懸后的液體以12 000×g 離心2 min后收集上清液,轉(zhuǎn)移至外泌體分離柱中,再以3 000×g 離心10 min并收集柱管底部液體,得到純化的外泌體。采用天根生化miRcute miRNA提取分離試劑盒進(jìn)行外泌體提取。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),提取血清外泌體中的miRNA,離心后收集吸附柱底的miRNA,再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 采用天根生化miRcute增強(qiáng)型miRNA互補(bǔ)DNA(cDNA)第1鏈合成試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)將提取的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件為:42 ℃,60 min;95 ℃,3 min。采用天根生化miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒,按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。miR-21正向引物序列為5′-GGGTAGCTTATCAGACTGATGTT-3′,反向引物序列為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6內(nèi)參正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃,15 min;60 ℃,34 s;94 ℃,20 s。共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.3其他臨床指標(biāo)檢測(cè) 紅細(xì)胞沉降率(ESR)采用由意大利Vital Monitor-100全自動(dòng)ESR儀檢測(cè)。CRP、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4分別采用美國(guó)Biovision人CRP 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、美國(guó)ThermoFisher人補(bǔ)體C3 ELISA試劑盒和美國(guó)ThermoFisher人補(bǔ)體 C4 ELISA試劑盒按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。采用上海信裕生物人抗心磷脂-免疫球蛋白(Ig)A抗體(ACA-IgA)ELISA試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)對(duì)血清ACA水平進(jìn)行檢測(cè)。采用廣州奧瑞達(dá)生物血清循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)ELISA試劑盒檢測(cè)CIC水平。

1.2.4器官損害判斷 以尿蛋白>0.5 g/24 h為腎臟受損標(biāo)準(zhǔn);以2個(gè)以上關(guān)節(jié)疼痛并出現(xiàn)炎癥反應(yīng)體征(壓痛、腫脹、滲出)為關(guān)節(jié)受損標(biāo)準(zhǔn);以潰瘍、壞疽、有觸痛的手指小結(jié)節(jié)、甲周微血管病變、裂片形出血或經(jīng)活檢、血管造影證實(shí)的血管炎為血管損害標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)并比較合并與未合并器官損害pSLE患者的miR-21相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1不同組別miR-21相對(duì)表達(dá)水平比較 低活動(dòng)組pSLE患者有22例,高活動(dòng)組pSLE患者有26例,pSLE組miR-21相對(duì)表達(dá)水平高于健康對(duì)照組(1.193±0.181vs.0.913±0.079),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.995,P<0.05)。高活動(dòng)組pSLE患者miR-21相對(duì)表達(dá)水平高于低活動(dòng)組(1.258±0.172vs.1.117±0.164),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.890,P=0.006)。

2.2健康對(duì)照組、高活動(dòng)組和低活動(dòng)組其他臨床檢測(cè)指標(biāo)水平比較 健康對(duì)照組、高活動(dòng)組和低活動(dòng)組ESR、CRP、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、ACA、CIC水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高活動(dòng)組和低活動(dòng)組患者ESR、CRP水平顯著高于健康對(duì)照組,且高活動(dòng)組顯著高于低活動(dòng)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高活動(dòng)組和低活動(dòng)組補(bǔ)體C3、C4水平低于健康對(duì)照組,且高活動(dòng)組低于低活動(dòng)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高活動(dòng)組患者血清ACA和CIC水平顯著高于低活動(dòng)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 健康對(duì)照組、高活動(dòng)組和低活動(dòng)組其他臨床檢測(cè)指標(biāo)水平比較

2.3合并與未合并器官損害pSLE患者的miR-21相對(duì)表達(dá)水平比較 有腎臟和關(guān)節(jié)損害的pSLE患者的miR-21相對(duì)表達(dá)水平高于無(wú)損害患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);合并和未合并血管損害的pSLE患者miR-21相對(duì)表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 合并與未合并器官損害pSLE患者的miR-21相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4pSLE患者miR-21相對(duì)表達(dá)水平與ESR和CRP的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,pSLE患者miR-21相對(duì)表達(dá)水平與ESR、CRP水平呈正相關(guān)(r=0.286、0.389,P<0.05),見(jiàn)圖1。

注：A表示ESR與miR-21的相關(guān)性;B表示CRP與miR-21的相關(guān)性。

2.5pSLE患者miR-21相對(duì)表達(dá)水平與血清免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,pSLE患者miR-21相對(duì)表達(dá)水平與補(bǔ)體C3、C4水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.346、-0.330,P<0.05),與血清ACA、CIC水平呈正相關(guān)(r=0.499、0.326,P<0.05),見(jiàn)圖2。

注：A表示補(bǔ)體C3與miR-21的相關(guān)性;B表示補(bǔ)體C4與miR-21的相關(guān)性;C表示ACA與miR-21的相關(guān)性;D表示CIC與miR-21的相關(guān)性。

2.6miR-21對(duì)pSLE的診斷效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-21診斷pSLE的曲線下面積(AUC)為0.945(95%CI:0.902～0.989)。當(dāng)miR-21最佳截?cái)嘀禐?.023時(shí),診斷pSLE的靈敏度為85.4%,特異度為94.0%,見(jiàn)圖3。

圖3 miR-21診斷pSLE的ROC曲線

3 討 論

SLE可發(fā)生于所有年齡段的女性,尤其好發(fā)于育齡女性[4]。SLE本身并不降低女性的生育率,但會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響,可造成母體靜脈血栓栓塞及腎損傷,以及流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎兒發(fā)育阻滯等后果[10]。另一方面,有研究對(duì)pSLE患者相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),通過(guò)藥物治療或提前分娩等方式可在很大程度上改善妊娠結(jié)局[11]。因此,如何精準(zhǔn)預(yù)測(cè)患者的病情成為目前治療pSLE的一大問(wèn)題。本研究結(jié)果顯示,高活動(dòng)組和低活動(dòng)組血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組,且高活動(dòng)組高于低活動(dòng)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ESR與CRP是高靈敏的炎癥標(biāo)志物,在pSLE患者中水平升高;補(bǔ)體C3、C4在炎癥與免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,在pSLE患者中水平下降[12-13]。本研究結(jié)果顯示,pSLE患者血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)指標(biāo)ESR和CRP、免疫反應(yīng)指標(biāo)ACA、CIC呈正相關(guān)(P<0.05),與補(bǔ)體C3、C4呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清miR-21診斷pSLE具有較高的靈敏度及特異度。并且,合并腎臟和關(guān)節(jié)損傷的pSLE患者血清miR-21相對(duì)表達(dá)水平比未合并腎臟及關(guān)節(jié)損害的患者高。這些結(jié)果表明,血清miR-21的相對(duì)表達(dá)水平與pSLE患者的疾病活動(dòng)度和器官累及程度相關(guān),miR-21是評(píng)估pSLE患者病情的新的潛在生物標(biāo)志物。

miRNA已被證實(shí)在SLE進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。多種miRNA在SLE患者免疫細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)或下調(diào),并參與了T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的異常活化[14]。例如,miR-7可促進(jìn)SLE患者B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞分化,miR-21則引起T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化[15-16]。miRNA表達(dá)譜的改變與SLE病情的進(jìn)展高度相關(guān)[7,16]。并且,miRNA表達(dá)水平還與SLE相關(guān)器官損害程度相關(guān),包括狼瘡性腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化和心血管損害[17]。因此,血清miRNA可成為評(píng)估SLE病情的潛在生物標(biāo)志物。例如,miR505-3p在SLE患者血漿中表達(dá)水平升高并與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān),是輔助診斷SLE的潛在生物標(biāo)志物[18]。但miRNA在評(píng)估pSLE患者的診斷效能的報(bào)道較少。另一方面,血液中裸露的miRNA在RNA酶的作用下往往快速降解,使其直接分離,導(dǎo)致檢測(cè)血清miRNA的靈敏度和特異度較低。

外泌體是一種直徑介于30～150 nm的球形脂質(zhì)囊泡,其內(nèi)包含蛋白質(zhì)和miRNA等生物活性物質(zhì),廣泛參與多種疾病的發(fā)展過(guò)程,并因其可進(jìn)入血液循環(huán)而成為潛在的理想監(jiān)測(cè)靶標(biāo)。外泌體已被證明在SLE疾病進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[19]。現(xiàn)有證據(jù)表明,循環(huán)外泌體的水平與SLE的疾病活動(dòng)顯著相關(guān)[20]。人體尿液、血清和唾液中的細(xì)胞外miRNA多數(shù)集中在外泌體中,使得它們?cè)谥|(zhì)雙分子層的保護(hù)下不被RNA酶降解[7]。miRNA不僅在SLE發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,還是一種診斷pSLE的潛在生物標(biāo)志物[7]。因此,分離純化并檢測(cè)體液中的miRNA相對(duì)表達(dá)水平,是評(píng)估pSLE病情進(jìn)展的一種高靈敏手段。

已有證據(jù)表明,血清miRNA含有多種疾病的指紋圖譜,并能夠?qū)LE從其他炎癥疾病中辨別出來(lái),使得體液中miRNA成為潛在診斷SLE的生物標(biāo)志物,另外,miR-21在SLE患者中呈高水平表達(dá)并與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān),在活躍和非活躍SLE患者中呈現(xiàn)出表達(dá)差異,在病情緩解患者血液中表達(dá)下降[21]。最新的研究顯示,抑制miR-21相對(duì)表達(dá)水平可顯著改善狼瘡表型,包括皮膚損害和狼瘡性腎炎[22]。這些結(jié)果使得miR-21成為預(yù)測(cè)SLE疾病進(jìn)展的一項(xiàng)潛在生物標(biāo)志物,但其在pSLE患者中的表達(dá)和作用前期報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示,血清miR-21可較好地用于評(píng)估pSLE患者臨床疾病活動(dòng)和器官損害,并對(duì)pSLE患者具有較高的診斷靈敏度和特異度。因此,血清miR-21可作為評(píng)估pSLE患者病情的潛在生物標(biāo)志物,有助于更精確地評(píng)估和預(yù)測(cè)病情進(jìn)展,為及時(shí)采取措施改善病情和妊娠結(jié)局提供依據(jù)。