γδT淋巴細胞及其亞型在毒性彌漫性甲狀腺腫中的分布研究

王姜琳,梁冬雨,汪國慶,趙江峰,湯明明,楊慧健

1.上海市嘉定區中心醫院檢驗科,上海 201800;2.上海市嘉定區中心醫院中心實驗室,上海 201800;3.上海市嘉定區中心醫院風濕免疫實驗室,上海 201800;4.上海市嘉定區中心醫院內分泌科,上海 201800;5.上海中冶醫院檢驗科,上海 200941

毒性彌漫性甲狀腺腫(GD)是一種器官特異性自身免疫性疾病。臨床上85%的甲狀腺功能亢進均由GD引起[1],患者血清中常存在多種自身抗體,特別是針對促甲狀腺激素(TSH)受體的抗促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)。隨著醫學科學技術的發展,甲狀腺疾病的研究和臨床治療技術取得了進展。但GD與其他自身免疫性疾病一致,存在普遍療效不佳、尚無有效治療手段的局限,其根本原因在于GD的發病機制尚不清楚。有研究表明GD的發病機制可能與環境、表觀遺傳及免疫學機制等因素有關[2]。人類γδT淋巴細胞作為T淋巴細胞中的一個特殊群體,主要有Vδ1γδT淋巴細胞和Vδ2γδT淋巴細胞2個亞群。LIU等[3]的研究證實橋本甲狀腺炎(HT)中γδT淋巴細胞活化能夠輔助B淋巴細胞產生抗體,而GD類似于HT也是一種以自身體液免疫反應為主要特點的自身免疫性甲狀腺疾病,可能與HT存在著相似的免疫學發病機制。本文通過研究γδT淋巴細胞及其不同亞型在GD中的分布情況,分析GD中γδT淋巴細胞表面活化標志物與協同刺激分子的表達水平,探討γδT淋巴細胞在GD免疫學發病機制中可能的作用,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年6-12月上海市嘉定區中心醫院(以下簡稱本院)內分泌門診確診的GD患者59例作為GD組,其中男16例,女43例,平均年齡為(40.31±11.34)歲;另選擇同期65例健康志愿者作為對照組,其中男21例,女44例,平均年齡為(40.72±12.80)歲。兩組年齡、性別等一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。GD的診斷標準參考《中國甲狀腺疾病診治指南:甲狀腺疾病的實驗室及輔助檢查》[4],(1)臨床表現:①甲狀腺功能亢進癥狀或體質量減輕、心動過速、出汗等;②甲狀腺彌漫性腫大;③眼球突出或其他浸潤性眼征。(2)實驗室檢查結果:①甲狀腺激素水平升高;②TSH水平降低;③TRAb或甲狀腺刺激抗體(TSAb)陽性;④甲狀腺對放射性碘(或99TcmO4-)攝取能力提高。以上診斷標準中,符合以下3種情況可作為GD納入標準:(1)至少具有1項臨床表現和4項實驗室檢查結果均異常;(2)至少具有1項臨床表現和實驗室檢查中3項結果異常;(3)至少具有1項臨床表現和實驗室檢查中1～2項結果異常,且血清中游離甲狀腺素(FT4)水平升高維持至少3個月以上。排除標準:(1)有其他器質性疾病或自身免疫性疾病;(2)正在使用免疫抑制劑。所有研究對象均知情同意本研究并簽署知情同意書,本研究經本院醫學倫理委員會審核批準通過(批準文號:2019K06)。

1.2儀器與試劑 別藻藍蛋白(APC)抗人CD3、藻紅蛋白(PE)抗人T淋巴細胞表位γδT(TCR γδT)、PE抗人TCR Vδ1γδT、PE抗人TCR Vδ2γδT、異硫氰酸熒光素(FITC)抗人CD69、FITC抗人HLA-DR、FITC抗人CD40配體(CD40L)、FITC抗人誘導性共刺激分子(ICOS)抗體等流式抗體均購自美國BD公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)及ficoll淋巴細胞分離液等購自上海生物工程有限公司。所用流式細胞儀為FACSCantoⅡ(美國BD公司),全自動化學發光免疫分析儀(MAGLUMI X8購自深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司,雅培a3600免疫流水線購自雅培醫療用品(上海)有限公司,游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體 (TG-Ab)、TRAb、FT4、TSH檢測試劑均來自雅培醫療用品(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1檢測兩組甲狀腺相關指標 取紅管促凝血3 mL,離心分離血清,采用化學發光法分別檢測甲狀腺相關指標,包括FT3、FT4、TSH、TPOAb、TG-Ab、TRAb。

1.3.2分離外周血單個核細胞(PBMC) 取肝素抗凝新鮮靜脈血4 mL,用PBS(1∶1)稀釋后,沿管壁緩慢加入至含有等體積ficoll淋巴細胞分離液的試管中,2 500 r/min離心20 min;吸取試管中間白色界面層至另一試管中,加入5 mL PBS清洗1次,1 500 r/min離心5 min后棄上清液,再重復清洗1次。輕輕倒去上清液后將細胞沉淀輕輕彈勻,得到所需細胞。

1.3.3流式細胞術檢測 γδT淋巴細胞及其亞型的比例 取2×105個PBMC于試管內,重懸于100 μL PBS中,分別加入相應熒光標記的單克隆抗體APC-抗人CD3,PE-抗人TCR γδT、PE-抗人TCR Vδ1γδT、PE-抗人TCR Vδ2γδT,充分混勻,室溫下避光靜置20 min。PBS 2 mL洗滌2次,每次1 500 r/min離心10 min,將細胞重懸于400 μL含有4%多聚甲醛的PBS中,置于4 ℃環境下避光保存待測。

1.3.4流式細胞術檢測γδT淋巴細胞表面活化分子D69、HLA-DR和協同刺激分子CD40L及ICOS的表達水平 取2×105個PBMC于試管內,重懸于100 μL PBS中,加入APC-抗人CD3,PE-抗人TCR γδT, FITC-抗人CD69、抗人HLA-DR、抗人CD40L及抗人ICOS等抗體,室溫下避光靜置20 min,PBS 1 mL洗滌2次后,每次1 500 r/min離心10 min,將細胞重懸于400 μL含4%多聚甲醛的PBS中,置于4 ℃環境下避光保存待檢。

2 結 果

2.1兩組血清甲狀腺相關指標比較 GD組TSH水平低于對照組,FT3、FT4、TPOAb、TG-Ab、TRAb水平均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清甲狀腺相關指標比較

2.2兩組外周血中γδT淋巴細胞及其亞型比例比較 兩組γδT淋巴細胞比例比較,差異無統計學意義(P>0.05)。GD組Vδ1γδT淋巴細胞比例高于對照組,Vδ2γδT淋巴細胞比例低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組外周血中γδT淋巴細胞及其亞型比例比較

2.3兩組γδT淋巴細胞表面活化分子及協同刺激分子的表達水平比較 GD組γδT淋巴細胞表面活化分子CD69、HLA-DR表達水平及協同刺激分子CD40L、ICOS的表達水平均明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組γδT淋巴細胞表面活化分子及協同刺激分子的表達水平比較

3 討 論

GD是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病。好發于30～60歲的人群,多見于女性,男、女發病比例為1∶8,發病率分別為0.5%、3.0%[5-6]。典型臨床表現包括高代謝癥候群、甲狀腺腫大和眼病3個方面。GD同許多其他自身免疫性疾病一樣,缺乏有效治愈手段,經抗甲狀腺藥物治療后復發率高達30%～50%[7],其根本原因在于目前對GD的認識不足,且治療措施主要為對癥治療。有研究結果顯示GD的發病機制非常復雜,涉及免疫、遺傳、環境、性別等諸多因素,其中免疫功能紊亂對其發生、發展起著核心作用[8],該疾病的特征是機體產生了病理性的自身抗體TRAb和TPOAb,本研究中GD組TPOAb、TG-Ab、TRAb水平均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),與GD的特征相符。而GD中高滴度的抗體提示機體中具有能夠輔助B淋巴細胞產生抗體的輔助性T淋巴細胞存在。

在B淋巴細胞功能活化并產生抗體的過程中,輔助性T淋巴細胞發揮著至關重要的作用[9]:(1)活化的T淋巴細胞通過抗原遞呈、上調細胞表面分子等途徑增強T/B淋巴細胞間的相互作用,促使B淋巴細胞活化并進一步分化為漿細胞且產生抗體;(2)活化的輔助性T淋巴細胞可分泌多種細胞因子參與抗體的類別轉換,從而調節體液免疫應答。B淋巴細胞活化并產生抗體的過程中,ICOS及其配體(ICOSL)、CD40及CD40L、淋巴細胞功能相關抗原和細胞間黏附分子等分子共同形成輔助性T淋巴細胞與B淋巴細胞間的免疫突觸,參與T/B淋巴細胞間的相互作用,并介導T淋巴細胞傳導B淋巴細胞活化信號[10]。

人類T淋巴細胞是一個復雜的細胞群體,根據其表面受體TCR的不同,可以將T淋巴細胞分為αβT淋巴細胞與γδT淋巴細胞2類。人類γδT淋巴細胞表面受體TCR由γ和δ 2條肽鏈組成,根據γδ鏈表達不同分為Vδ1γδT、Vδ2γδT與Vδ3γδT淋巴細胞3個主要的細胞亞群,其中Vδ1γδT、Vδ2γδT這2個亞群占γδT淋巴細胞的90%以上。γδT淋巴細胞相似于αβT淋巴細胞,又有別于αβT淋巴細胞,αβT淋巴細胞主要參與特異性免疫應答,而γδT淋巴細胞兼具特異性和非特異性免疫應答雙重特征。γδT淋巴細胞多分布在上皮和黏膜等處,在抗感染免疫和腫瘤免疫中發揮著重要作用[11-12], γδT淋巴細胞在自身免疫性疾病中如何發揮作用目前尚不很清楚,但有研究表明γδT淋巴細胞與自身免疫性疾病的發病過程密切相關[13], 文獻[14]中報道在類風濕關節炎(RA)的滑膜、硬皮病的皮膚,以及系統性紅斑狼瘡、原發性干燥綜合征、成人Still病、過敏性紫癜及白血病的外周血中γδT淋巴細胞數目及亞群均存在改變。在健康人外周血T淋巴細胞中,γδT淋巴細胞所占比例甚少,僅為1%～5%。Vδ1γδT、Vδ2γδT淋巴細胞2個亞群作為γδT淋巴細胞2個主要細胞亞群,具有各自的分布特點,Vδ1γδT淋巴細胞主要分布于皮膚、小腸黏膜和器官等組織,血液中有少量分布;Vδ2γδT淋巴細胞主要分布于血液中,胸腺和黏膜上皮組織中也有少量分布。劉紅利等[15]研究發現HT患者甲狀腺組織中γδT、Vδ1γδT淋巴細胞比例較單純甲狀腺腫患者甲狀腺組織中γδT、Vδ1γδT淋巴細胞比例明顯上調,兩組間Vδ2γδT淋巴細胞比例無明顯差異,并且HT患者甲狀腺組織中以Vδ1γδT淋巴細胞為主,符合上述Vδ1γδT淋巴細胞的分布特點;此外其研究也提示HT患者外周血γδT淋巴細胞比例略高于健康對照組,但無明顯差異,HT患者外周血Vδ1γδT淋巴細胞比例明顯高于健康對照組,而Vδ2γδT淋巴細胞比例略低于健康對照組,無明顯差異,其具體原因尚未闡明。本研究中兩組γδT淋巴細胞比例比較,差異無統計學意義(P>0.05)。GD組Vδ1γδT淋巴細胞比例高于對照組,Vδ2γδT淋巴細胞比例低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。此研究結果與劉紅利等[15]的研究一致,可能因為GD類似于HT也是一種以自身體液免疫反應為主要特點的自身免疫性甲狀腺疾病。

一些學者認為,γδT淋巴細胞可作為抗原遞呈細胞,并且可與其他細胞相互作用調節免疫反應。同時,γδT淋巴細胞分泌的細胞因子又可以通過增強或抑制免疫球蛋白產生及非特異性的殺傷功能等進一步影響這些疾病的病理進程[16-17]。RA炎癥關節的滑液中的γδT 淋巴細胞以表達Vδ2γδT的亞群為主,同時表達CD69、CD45RO等活化標志物;用異戊烯焦磷酸刺激培養后能夠上調表達抗原遞呈細胞樣特定細胞分子HLA-DR、CD80/86水平,并且將一些可溶性抗原和合成肽呈遞給CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞,從而導致CD4+T淋巴細胞持續活化,與RA的發生、發展密切相關[18-20]。綜合這些研究成果,表明γδT淋巴 細胞參與了自身免疫性疾病的發生、發展過程,在其過程中具有抗原提呈、免疫調節、輔助T淋巴細胞的功能。另有研究發現在HT中,活化的γδT淋巴細胞通過表達協同刺激分子(CD40L、ICOS)能夠輔助B淋巴細胞產生抗體[3],GD也作為一種以自身體液免疫反應為特點的自身免疫性疾病,它很可能同HT存在著相同或相似的發病機制。 本研究結果顯示,GD組γδT淋巴細胞表面活化分子CD69、HLA-DR表達水平及協同刺激分子CD40L、ICOS的表達水平均明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述,γδT淋巴細胞功能活化及其表達協同刺激分子(CD40L、ICOS)可能是促進GD產生自身抗體并誘導自身體液免疫應答重要病理機制之一,但具體作用則有待于進一步研究。